Universidad Veracruzana

Unidad de Ciencias de la Salud

Facultad de Bioanálisis

MANUAL DE PRACTICAS CLINICAS. HEMATOLOGÌA III

Dr. Guillermo Rodríguez Magaña

HEMATÓLOGO – PATÓLOGO CLÍNICO

Año de 1993

Manual de Practicas de Laboratorio.

Práctica No. 1

Tipificación del sistema ABO

Objetivo: Al término de la práctica el alumno determinara los cuatro grupos sanguíneos en sangre del sistema ABO.

Generalidades: En la membrana del glóbulo rojo existen complejos químicos que representan los llamados grupos o factores sanguíneos Fué Landsteiner quién realizó en 1900 el importante descubrimiento de que los eritrocitos del hombre pertenecen a varios sistemas Antigénicos diferentes, este autor descubrió el sistema A B O.

La clasificación del grupo sanguíneo está, determinada por la presencia o ausencia de los aglutinógenos en el eritrocito y las aglutininas en el suero. Para la identificación del grupo sanguíneo ABO se deben hacer dos investigaciones consecutivas: la primera se llama tipado globular y es la determinación de los aglutinógenos eritrocíticos con antisueros o aglutininas conocidas, la segunda se llama tipado sérico o contratipado y es la identificación de las aglutininas utilizando glóbulos rojos con antisueros conocidos, los sueros patrones deben ser de alto titulo, estos sueros pueden ser preparados en el laboratorio o en su defecto, se consiguen en las casas comerciales de productos biológicos. La investigación de los aglutinógenos eritrociticos se deben realizarse por el método de tubo de ensayo.

Se utilizan tres reactivos llamados: suero anti A (de sangre b), de color azul y que contiene aglutininas alfa, suero anti B (de sangre a), de color amarillo y que contiene aglutininas beta, existe además otro suero, el anti AB que contiene las dos aglutininas, alfa y beta.

Fundamento: Los antígenos de los hematíes son estructuras químicas que proporcionan propiedades específicas a su superficie y que solo pueden detectarse con anticuerpos que corresponden a esos antígenos la mayoría de estas reacciones antígeno-anticuerpo implican la aglutinación o hemólisis de los hematíes.

Material y equipo:

Ø 1 gradilla
Ø 16 tubos 10 x 75
Ø 4 tubos 13 x 100
Ø 4 pipetas Pasteur con bulbo
Ø Centrifuga clínica
Ø Centrífugas Serofuge
Ø Sueros hemoclasificadores Anti-A, Anti B. Anti-AB
Ø Albúmina bovina al 22% o 33%
Ø Solución fisiológica en Pizeta
Ø Sangre problema

Tipificación en tubo.

Técnica:

Se prepara una suspensión de glóbulos rojos al 5%, previamente lavado en solución fisiológica.
En una gradilla colocar 4 tubos de ensaye de 10 x 75, marcados con las letras A, B, AB y Control.
En cada tubo poner una gota de suspensión de glóbulos rojos al 5%.
En el tubo marcado con A poner una gota de suero anti A, en el tubo marcado con B, poner una gota de suero anti B, en el tubo AB una gota de suero anti AB
Se debe hacer un control agregando a 1 tubo con una gota de albúmina bovina al 22 %
Mezclar perfectamente los tubos y dejar reposar por dos minutos.
Mezclar nuevamente y se procede a centrifugar a 2,500 r p m durante un minuto
Se sacan los tubos cuidadosamente de la centrifuga evitando que se mezclen los glóbulos rojos que quedan depositados en el fondo de los tubos y para efectuar la lectura se sacuden cuidadosamente el botón del fondo, uno por uno buscando si existe aglutinación macroscópica.
Si la aglutinación tuvo lugar, puede comprobarse en el seno del liquido claro los hematies que nadan y se flotan formando pequeños agrupamientos, si el resultado es negativo los glóbulos rojos se distribuyen uniformemente por el líquido.

10. El resultado se reporta de acuerdo a la intensidad del grupo y al color del liquido sobre nadante, de una o varias cruces, hasta cuatro.

11. Si existe duda en la lectura se podrá observar al microscopio una gota o también se pueden incubar los tubos a 37° C. durante 30 minutos.

Contratipado sanguíneo o prueba de Wiener

Objetivo: Al contrario de las: pruebas anteriormente descritas que emplean sueros testigos, esta prueba utiliza glóbulos rojos testigos tipo A, B y AB en suspensión al 5% y suero de la persona a clasificar la prueba puede realizarse en tubo, de acuerdo con las técnicas antes descritas

Interpretación de resultados:

Grupo sanguíneo aglutinación en tubo

	Anti A	Anti-B	Anti AB
Grupo A	Positivo	Negativo	Positivo
Grupo B	Negativo	Positivo	Positivo
Grupo AB	Positivo	Positivo	Pos itivo
Grupo O	Negativo	Negativo	Negativo

Es recomendable que la tipificación al realizarse, los resultados son más confiables tubo, ya que la aglutinación se puede expresar en cruces, de una a cuatro, dependiendo del grado de la misma.

4 cruces; la aglutinación se presentará como un botón sólido con fondo claro y grumos gruesos.

3 cruces; la aglutinación serán varios grumos grandes con el fondo claro o rosado

2 cruces pocos grumos y muy pequeños, una suspensión uniforme

1 cruz pocos grumos, muy pequeños, el fondo muy rosado.

Negativo: Una suspensión uniforme de color rojo.

Comentarios: Los principales errores que pueden existir en la clasificación sanguínea, son los siguientes:

Error en la preparación de la suspensión de glóbulos rojos así si se ha colocado demasiada sangre (mezcla de color rojo intenso) en exceso de glóbulos rojos puede absorver la aglutinina del suero y no evidenciar la aglutinación.

Si se ha colocado poca sangre (La mezcla color rosa muy pálido) la escases de glóbulos dificultará la lectura macroscópicamente.

Con respecto a los sueros hemoclasificadores:

a) pueden estar envejecidos, mal preparados y su potencia débil. contaminado control de calidad se observa turbio y de mal olor.

b) con respecto a las sangres: sangres viejas o contaminadas con bacterias.

c) con respecto a la manipulación:

Ø rotulación equivocada de los tubos
Ø colocación erronea de los reactivos
Ø equivocación en los reportes.

Practica No 2

Tipificación del subgrupo de “A” uso de Lectina A1

Objetivo: Al terminar la práctica, el alumno al haber encontrado un grupo «A» determinará si se trata de un subgrupo A1 o A2

Generalidades: Los eritrocitos que poseen antígeno A pueden ser subdivididos en Al y A2, las células rojas del grupo A que aglutinen con Anti Al lectina, se consideran del subgrupo, aquellas que no aglutinan con Anti A1 lectina, se clasifican como A2. Aproximadamente el 80 % de las células, son Al y el restante 20% se consideran A2.

Principio: Los procedimientos usados con este reactivo, están basados en el principio de aglutinación, las células humanas normales, conteniendo antígenos se aglutinan en presencia del anticuerpo del antígeno correspondiente algunos extractos de semillas lectina contienen aglutininas con especificidad de grupos sanguíneos humanos, el extracto de la semilla dolichus biflorus es virtualmente específica para el antígeno Al en células rojas humanas contiene un fito hemo aglutinina, la cual como se dijo anteriormente aglutina las células rojas de los subgrupos Al o A1B.

Material y equipo:

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos ensaye 10 x 75
Ø 2 pipetas Pasteur con bulbo
Ø 1 centrifuga clínica o Serofuge
Ø Suero Anti-Al lectina
Ø Solución salina en pizeta.

Método en tubo.

Preparar una suspension de glóbulos rojos en solución salina al 5%
Colocar una gota de Anti A Lectina en un tubo de 10x 75
Con una pipeta Pasteur, agregar una gota de la suspensión de glóbulos rojos.
Mezclar bien y centrifugar a 2500 r.p.m por un minuto.
Resuspender los glóbulos rojos cuidadosamente y examinar el tubo en busca de aglutinación.

Interpretación.

Cuando los glóbulos rojos son aglutinados la reacción es positiva e indica la presencia de antígeno A1 y por lo tanto los glóbulos rojos son A1
Cuando los glóbulos rojos no aglutinan, la reacción es negativa e indica la ausencia de antígeno A1 y los glóbulos rojos son A2
Cuando se investiga en una sangre AB, con Antia Al lectina, si aglutina es AlB, si no aglutina es A2B

Comentarios: No se requiere preparación especial del paciente previo a la recolección de los especimenes, puede usarse sangre recolectada con o sin Anticoagulantes. Las muestras de sangre deben ser analizadas lo antes posible después de la obtención. Si el análisis tiene que ser retrasado, las muestras deben conservarse bajo refrigeración entre 2 y 8° C.

Los glóbulos rojos recolectados y conservados en citrato de sodio, oxalato de amonio; con oxalato de potasio han de mostrado que mantienen su reactividad por 28 días. Los glóbulos rojos recolectados y conservados con sangre coagulada o en citrato de sodio u oxalato de sodio, han demostrado su reactividad por lo menos durante 14 días; si los hematíes se recolectan sobre EDTA o heparina, éstas deben ser analizadas dentro de las 48 horas.

Limitaciones del procedimiento:

Ø Todas las pruebas usando antisuero hemoagrupadores ABO, deben ser llevadas a cabo a temperatura ambiente y nunca incubarse a temperaturas más elevadas,
Ø El antígeno Al no es totalmente expresado en células rojas de recién nacidos y pueden obtenerse falsos negativos
Ø Glóbulos rojos de más de 28 días pueden ser probados con este reactivo aún cuando las reacciones positivas pueden ser más débiles que las obtenidas de glóbulos rojos frescos,
Ø Contaminación de los especimenes de sangro o de los materiales suplementarios usados, pueden interferir con los resultados de la prueba.

Práctica No 3

Tipificación del sistema Rho.

Objetivo: Al término de la práctica el alumno clasificará además del sistema sanguíneo ABO el factor Rho.

Generalidades: Además de los Antígenos del sistema ABO, existe otro sistema de mayor importancia que es el factor Rho.

Landsteiner y Wiener descubrieron en 1990 la existencia de un aglutinógeno en los glóbulos rojos humanos que llamaron factor Rho, a fin de recordar con las dos iniciales del mono rhesus. El mecanismo que permitió ponerlo en evidencia fue el inyectar glóbulos rojos lavados de dicho animal (macacus rhesus) en conejos, obteniéndose de este modo un suero capaz de aglutinar un 85% de los hematíes humanos.

El suero de conejo preparado en la forma indicada contenía la aglutinina correspondiente al factor Rho y se denominó Anti Rho, las personas cuyos glóbulos rojos eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh positivos, y los hematíes no eran aglutinados por el suero Anti Rho se denominaron Rh negativos, se comprobó que el 85% de las personas de raza blanca son Rh positivos y que el 15% restantes son Rh negativos, posteriormente se descubrió que el factor Rh no era el único, sino que se trataba de un factor muy complejo por tanto existen tres factores principales:

Ø El rir(nomenclatura de Wiener) o d (nomenclatura de Fisher race).
Ø El rh1 (nomenclatura de Wiener) o c (nomenclatura de Fisher race).
Ø El r1r» (nomenclatura de Wiener) o e (nomenclatura de Fisher race).
Ø Levine y Stetson describieron un caso de inmunización materno fetal en el segundo embarazo de una mujer que dio a luz un feto muerto.

La presencia del Anticuerpo inmune se comprobó al transfundirle sangre del esposo, compatible con el sistema ABO, con la que reaccionó violentamente, esto hizo suponer que la madre había elaborado Anticuerpos contra un Antígeno poseído por el feto, que a su vez había heredado del padre, esto hizo evidenciar la presencia de otro tipo de Anticuerpo que no tenía nada que ver con los del sistema ABO y así descubrió el factor Rho-

El sistema sanguíneo rh-hr está formado por un grupo de antígenos de naturaleza proteica la transfunsión de glóbulo rojos con estos factores, a pacientes que no los tengan, pueden dar lugar a la formación de Anticuerpos específicos estos Anticuerpos pueden ser la causa de reacciones post transfusionales severas o casos de inmunización materno fetal produciendo una anemia hemolítica por defectos extra corpusculares ya que los Anticuerpos maternos actúan sobre los glóbulos rojos normales; además de los ya descritos, existen otros, pero el más importante se le llama factor rh ó factor du.

Fundamento: El factor Rho. es un antígeno que se encuentra en la membrana del eritrocito el cual reacciona con su Anticuerpo correspondiente que se encuentra en el suero anti-D que contiene la aglutinina correspondiente al factor Rho, llamado también anti Rho, anticuerpos que se detectan, son del tipo de la IgG que poseen la capacidad de cruzar la barrera placentaria por su bajo peso molecular, iniciando por tanto la enfermedad. La presencia del factor Rho se pone de manifiesto mediante una reacción antígeno-anticuerpo y se observa por aglutinación y hemólisis.

Material y equipo:

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos 10 x 75
Ø 4 tubos 13 x 100
Ø 4 pipetas Pasteur con bulbo
Ø Centrifuga Serofuge
Ø Suero Anti-D
Ø Antiglobulina humana
Ø Solución Salina en pizeta
Ø Baño maria a 37oC

Método en tubo:

Técnica: Se prepara una suspensión de glóbulos rojos en solución fisiológica al 5%

En un tubo de ensayo 10 x 75, se coloca una gota de suero anti Rho (D) y se le agrega una gota de suspensión de los eritrocitos problema al 5%
Se homogeniza con un movimiento suave, se centrifuga a 3,500 r.p.m- durante 30”
Se realiza la lectura, en busca de aglutinación, en caso de duda se incuba durante 15’ al cabo de este tiempo se efectua lectura, suspende suavemente el sedimento.
Nuevamente se centrifuga durante 30″ a 3,500 r.p.m. se rea liza la lectura
Se observa aglutinación con grumos visibles, si hay duda se confirma la lectura mediante observación microcópica.

Interpretación de resultados.

Ø Si la sangre examinada Rho. positiva se nota la formación grumos facilmente observables a simple vista.
Ø En caso de ser Rho. negativo el aspecto es homogéno, no existe aglutinación.

Práctica No. 4

Determinación de antígeno Du

Objetivo: El alumno investigara la presencia de variante Du que es una expresión débil o incompleta de un factor del Rho, pero con capacidad antigénica.

Introducción:

El Du, es un alelo de D, muy importante pero irregular. No existe suero anti-Du específico. Algunas sangres Du deben esta característica al hecho de que el factor D normal heredado, de uno de los padres, está enmascarado por el factor C de un cromosoma aparejado dCe (r´) heredado de otro progenitor: este tipo se conoce como “Du por interacción genética”. El otro tipo “Du hereditario” puede atribuirse a transmisión de un D debilitado.

Los glóbulos de algunos sujetos Du pueden ser aglutinados directamente por casi todos los sueros anti D, estos casos se denominan”Du” de titulo elevado”. Otras sangres Du son aglutinados solamente por unos cuantos sueros anti D; son los “Du de título bajo”. Lo importante respecto a los glóbulos Du, especialmente la variedad “titulo bajo”, es que probablemente parecerán Rho. Negativos al ser mezclados con anti D. Solamente podrán reconocerse mediante:

1) Modificación enzimática previa, o sea, ficnización

2) Exposición previa al suero anti D incompleto y luego prueba de Coombs. Los glóbulos Du dan una prueba de Coombs positiva en estas circunstancias. Se recomienda el segundo método.

Otra consideración todavía más importante respecto al Du, es que todos los que poseen el alelo Du deben considerarse como donadores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Positivos, pero receptores Rho. Negativos. Esto se debe a que el Du puede producir anti D en un sujeto Rho. Negativo, y también a que algunos Du producen ellos mismos anti D. Además los sujetos Du por “acción intergenética” no deben recibir sangre que contenga el antígeno c, muy potente, en otras palabras, debe recibir sangre del genotipo Dce/dCe o DuCe/dCe esta última generalmente corresponde a su propio genotipo.

Fundamento:

Ciertos eritrocitos Rho.+, alrededor del 1% con mayor frecuencia en la raza negra que en la caucásica, no son aglutinados por el suero anti Rho. (anti D) pero después de ser expuesto a los anticuerpos Rho. (D), darán una reacción positiva si se tata con suero de Coombs.

Generalidades:

Los hematies del grupo D presentan diferencias en cuanto a su reactividad; se acepta que varios de los factores del sistema Rho. en ocasiones se expresan en forma débil o incompleta los más importantes son: el Du, el Cw y el Eu en realidad solo el Du tiene importancia en el banco de sangre debe sospecharse de ser Du, las sangres que son difíciles de clasificar como Rh positivos o negativos, utilizando solo el suero anti-D

El paciente Du positivo debe recibir sangre Du negativa ya que se han reportado casos que por recibir sangre Rho. positiva desarrollan anticuerpos Anti Rho. de especificidad Anti-D, elfactor Du de Stratton, como es débil no es fácil determinarlo, pero conserva su capacidad antigénica. Para investigar este grupo, la técnica de aglutinación con el suero Anti-D ha dado resultados débiles, sin embargo ha servido para que los Anticuerpos se fijen y la prueba de Coombs indirecta nos dará el resultado positivo; observando macroscópicamente el fenómeno de aglutinación: el Antigeno Du se determina por la aglutinación de los glóbulos rojos en presencia del suero Anti-D y Antiglobulina Humana

Material y equipo

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos 10 x 75
Ø 2 pipetas pasteur con bulbo
Ø 1 Centrifuga Sarofuge
Ø 1 baño maria a 370c
Ø Suero Anti-D
Ø Suero de Coombs
Ø Albúmina bovina al 22%
Ø Solución salina en pizeta

Método en tubo:

Preparar glóbulos Rho. negativos al 5%
Marcar dos tubos No 1 problema y No 2 control, agregar en cada tubo dos gotas de la suspensión de glóbulos rojos.
Al tubo No 1 agregar una gota de suero Anti-D y una gota de Albúmina bovina al 22%, al tubo No 2 dos gotas albúmina bovina al 22%
Mezclar y dejar reposar durante dos minutos
Centrifugar en busca de aglutinación
Lavar por tres ocasiones
Despues del último lavado, decantar completamente y agregar dos gotas de Antiglobulina humana a cada tubo
Incubar durante 15 minutos a 37° C
Centrifugar a 3,500 rpm x 1 minuto

10.Leer sobrenadante y despegar el boton del fondo del tubo cuidadosamente en busca de aglutinación

11.Reportar por escrito

Interpretación de resultados

Ø En el tubo control no debe encontrarse aglutinación.
Ø Si el tubo problema se observa con aglutinación se habla de la presencia del factor Du.
Ø Si hubiese aglutinación enlos dos tubos signifia que se trata de glóbulos rojos cubiertos o bloqueados, por lo tanto si se trata de donador la sangre será desechada

Práctica No. 5

Dosificación de Hemolisinas

Objetivo: Elalumno al finalizar la práctica detectará la presencia de hemolisinas en la sangre de tipo «O” (donador universal).

Generalidades: La hemólisis inmunnológica debida a la acción conjugada de dos factores, un anticuerpo específico de los glóbulos rojos, el complemento, el anticuerpo correspondiente es denominada hemolisina.

El primer paso en la reacción es la unión del anticuerpo con el antìgeno sobre la membrana del eritrocito, la unión con su anticuerpo homólogo inicia entonces la secuencia del complemento que produce la lesión litica. La sensibilidad óptima de un glóbulo rojo parece requerir aproximadamente 1000 molécuas de anticuerpo, pero requerimiento mínimo en una sola molécula de IgM o dos moleculas de IgG muy próximas, se ha observado que la cantidad del complemento necesaria para la hemólisis completa de deter minado número de células, está inversamente relacionada con la càntidad de anticuerpo suministrada.

Las isohemolisinas naturales son muy poco frecuentes, se ha señalado en algunos de los sitemas de grupos sanguíneos las isohemolisinas inmunes se observan después de inyectar sangre incompatibl

Las autohemolsimas bitermicas se ven en la hemoglobinuria paroxistica por enfriamento; son globulinas anormales del suero, capaces de hemolizar los glóbulos rojos del paciente mismo y de otras personas, se combinan los eritrocitos a temperaturas inferiores a los 20°C y no lo hacen por arriba de esta temperatura, cuando aumenta a 25°C empieza la hemólisis, que es optima a los 40°C las autohemolisinas monotérmicas con un margen detemperatura de 15 a 30°C, son causa de una destrucción excesiva de hematies, anémias hemolíticas, el complemento es termolábil y se destruye a 56°C, de 20 a 30 minutos el almacenamiento a 4°C significa pérdida de ésta actividad de 2 a 3 días.

Un anticuerpo puede reaccionar primero como hemolisina, pero si se inactiva o fija el complemento, reacciona como aglutinina.

La presencia de hemolisinas en el suero de un donante del grupo «O» indica que esa sangre solo puede ser transfundida a otro paciente del mismo grupo.

Fundamento: Se basa en la activación del complemento por la formación del complejo antigeno – anticuerpo, entre el antígeno de superficie del eritrocito y la hemolisina, poniendo suero problema ante suspensiones de globulos rojos «A» y «B». Se puede determinar el titulo de hemolisinas mediante diluciones del suero problema.

Material y equipo

Ø 1 gradilla
Ø 6 tubos10 x 75
Ø 3 pipetas Pasteur c/bulbo
Ø 3 pipeta 1/10
Ø 1 centrifuga Serofuge
Ø Solución salina normal
Ø Suero problema
Ø Globulos rojos «A»y «B»

Tecnica:

Preparar suspensiones al 5% en solución salina de Eritrocitos «A» y «B»
Marcar dos tubos con las letras A y B que corresponden al tipo sanguíneo
Depositar 0.1 ml de la suspensión de eritrocitos de cada grupo al tubo que corresponda
Añadir a cada tubo 0.1 ml de suero problema
Centrifugar a 2,500 rpm, durante 2 minutos
Observar si existe hemólisis en el sobrenadante de cada tubo, en caso de duda volver a centrifugar los tubos y reportar por escrito

Interpretacion de resultados:

Si a pesar de la centrifugación los glóbulos rojos no se sedimentan y el liquido del tubo es rojo, indica que los glóbulos rojos se han hemolisado
El suero de un donador «O» con hemolisinas, solo se aplicará a un receptor del mismo grupo, no se utilizará conpacientes «A» o «B «
Si el suero de una madre «O» hemolisa los glóbulos rojos de su hijo con eritroblástosis, es el causante de la isosensibilización de la madre

Observaciones:

Las muestras de sangre utilizadas en el estudio del complemento, de preferencia deben manejarse a temperatura ambiente (22°C ) debe separarse el suero del coagulo lo más pronto posible, para prevenir la pérdida de actividad del complemento.

Práctica No. 6

Dosificacion Aglutjninas

Objetivo: Al concluir la práctica el alumno identificará las aglutininas salinas de titulo elevado, que caracterizan la sangre del llamado «donador universal peligroso»

Generalidades: El sistema ABO es el único sistema en el que el plasma y suero inactivado, contienen aglutininas que reaccionan con factores sanguineos presentes en los eritrocitos de otras personas. Las isoaglutininas responsables de la aglutinación en el sistema ABO son del llamado completo, lo cuál quiere decir que la adeherencia del Ac al eritrocito que tiene factor sanguíneo homólogo, va seguido automaticamente del antígeno.

En casos de urgencia o escases del tipo sanguíneo necesario para una transfusión se empleará sangre tipo o llamada comunmente «donador universal», por carecer sus eritrocitos de aglutinógenos; pero si existen en el plasma aglutininas alfa o beta, que pueden presentar casos de aglutinación a los receptores, en los casos de títulos elevados. Hay que tomar precauciones, el riesgo de que las isoaglutininas transfundidas dañen a los hematíes del receptor, se podrán realizar este tipo de transfusiones sin peligro alguno, si se cumple con las siguientes normas:

El plasma de la sangre que ha de emplearse no de be contener aglutininas para los hematiés del futuro receptor
El titulo de isoaglutininas reactivas deberá ser inferior 1:80

La prueba cruzada menor debe realizarse con el suero neutralizado del donador, solo si esta prueba no da aglutinación, podrá emplearse la sangre sin riesgo. Sangre completa del «donador universal», para un receptor de otro grupo sanguíneo, los peligros relacionados con transfusiones de sangre de donadores universales, pueden reducirse al mínimo por la extracción parcial o completa del plasma.

En casos de transfusiones de urgencia, en las que es necesario reponer el vólumen sanguíneo perdido y no se puede esperar a practicar las pruebas cruzadas, se recomienda el uso de sangre «O» Rh negativa con títulos bajos de anti A y anti B y excenta de todos los anticuerpos irregulares.

Fundamento: Las aglutininas forman parte de los donadores universales. Para cuantificar el título de isoaglutininas, secuantifica cualquier reacción de aglutinación de Anti A y Anti B que persista en una dilución de 1:80 deberá considerarse de titulo elevado, donador universal peligroso.

Material y equipo:

Ø Gradilla
Ø 24 tubos de 10 x 75
Ø 3 tubos de 13 x 100
Ø 10 pipetas de 0 1
Ø 5 pipetas pasteur
Ø 2 pipeta 1ml
Ø 1 centrifuga Serofuge
Ø 1 baño maria 37°C
Ø Suero o plasma problema
Ø Solución salina normal
Ø Globulos rojos «A» y «B»

Técnica:

En la gradilla colocar 3 hileras de tubos de 10 x 75, de 8 tubos cada una, marcar los tubos de la primera hilera con: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1320, 1:640 y 1:1280,
Realizar diluciones del suero o plasma «O», poniendo 5 ml, de solución salina en cada uno de los tubos marcados, agregando 0 5m1, de suero o plasma del grupo «O» al primer tubo, mezclar y tomar 0,5 ml de esta suspensión y ponerla enel siguiente tubo y así sucesivamente hasta terminar desechando 0.5 ml de la suspensión final
Preparar supensión de glóbulos rojos en solución salina al 5% de los grupos «A» y «B», en los tubos de ensaye 13 x 100
Añadir 0.1 ml de la suspensión preparada anteriormente de glóbulos rojos del grupo «A» a los tubos de la segunda hilera y 0.1 ml de la suspensión de glóbulos rojos del grupo «B» a los tubos de la tercera hilera
Depositar 0.1 ml de suero «O» diluido a cada uno de los tubos que contienen los glóbulos rojos «A» y «B» teniendo cuidado de marcar correctamente los tubos con la dilución que se emplee
Incubar todos los tubos «A» y «B» a 37°C por treinta minutos
Centrifugar a 2500 rpm durante un minuto
Remover suavemente los glóbulos rojos sedimentados, observando si existe aglutinación macroscópica, reportar la aglutinación en cruces hasta el último tubo en que se encuentre

Interpretacion de resultados:

Se anotará la dilución a la que se ohservó la aglutinación en las dos hileras de tubos que contienen la sangre A y B

Aglutinación más de 1:80 se considera de titulo elevado y por lo tanto solo transfundir a paciente con sangre de su mismo tipo o sangre “O” pero solo concentrado eritrocitario.

Determinacion de Formula Roja

En el laboratorio del Banco de Sangre, de los exámenes que se practican al donador, se encuentra el que corresponde al estado que guarda su sangre, en la cantidad de hemoglobina que contiene, así como el conocimiento del hematocrito, que nos indica, si se encuentra normal o tiene algún grado de anemia que lo descartaría como donador, estos parámetros estan contemplados en la Norma Técnica que rige a los Bancos de Sangre.

Práctica No. 7

Cuantificacion de Hemoglobina

Objetivo: Determinar los valores de la hemoglobina en la sangre del disponente.

Generalidades: El elemento más importante en el eritrocito es la hemoglobina, se presenta inicialmente en los eritrocitos en desarrollo (normoblastos), está compuesta por el hem un pigmento con capacidad de transporte de oxígeno y la globina una proteína responsable de la especificidad de la especie y del transporte de anhidrido carbónico. En la molécula de hemoglobina hay cuatro subunidades, cada una de las cuales contiene un grupo hem anidado en una grieta hidrófoba de una cadena proteínica, la globina. El hem es un anillo tetrapirrólico con un ion de hierro ferroso que se encuentra próximo al exterior del anillo donde con facilidad puede combinarse con el oxígeno. Existen más de 40 variantes genéticas de hemoglobina humana, el recien nacido tiene hemoglobina F (fetal) que posteriormente se transforma en hemoglobina A (adulta),

Fundamento: Para conocer la cantidad de hemoglobina, se emplea una solución de ferrocianuro de potasio y cianuro de sodio para combinarse con una muestra de sangre el ferrocianuro convierte el hierro ferroso de la hemoglobina en férrico para formar metahemoglobina, la cual se combina con el cianuro de sodio, para formar cianometahemoglobina: la densidad del color producido es directamente proporcional a la cantidad de hemoglobina presente en la muestra y se registra en el fotocolorímetro.

Material y equipo.

Ø 2 tubos 13 x 100
Ø 1 pipeta volumetrica 5 ml
Ø 1 pipeta Sahli c/ boquilla
Ø Fotocolorimetro o espectofotómetro
10 ml cianometa o diluyente Drabkin
Ø Sangre obtenida con Edta

Tecnica:

Se toman 0.2 ml, de sangre con la pipeta de Sahli y se diluyen en 5 ml de solución de cianometa
Se deja reposar por 10 minutos
La densidad de la solución se mide fotocolorimetricamente a 540 nm utilizando un blanco de cianometa
El nivel de hemoglobina se obtiene, interpolando en una curva de calibración preparada previamente con patrones.

Valores de referencia:

Hombres de 15 a 18 grms por 100 ml

Mujeres de 13 a 15 grms por 100 ml

Interpretacion de resultados:

Se anotará los resultados obtenidos y en aquellos casos, valores menores de 13 grms, se descartan como disponentes.

Práctica No 8

Determinacion de Hematocrito

Objetivo: Determinar los valores del hematocrito en la sangre del disponente, por microhematocrito.

Generalidades: El hematocrito es el volúmen de eritrocitos expresados como un porcentaje del volúmen de sangre total, existente después de centrifugar una muestra de sangre.

Fundamento: Se basa en la separación de los glóbulos rojos y el plasma mediante una adecuada duración y velocidad de centrifugación capaz de separar el plasma y sedimentar los hematies el volumen del plasma que queda entre la masa globular empaquetada.

Material y equipo micrometodo:

Ø 1 tubo 13 x 100
Ø 2 capilares con heparina
Ø 1 mechero de alcohol
Ø 1 microcentrifuga
Ø 1 lector de microhematocrito
Ø Sangre del disponente
Ø Antocoagulante de oxalato de amonio y potasio

Tecnica:

El tubo de microhematocrito se llena por capilaridad a partir de una muestra de sangre venosa bién mezclada, ocupando dos capilares
Los tubos capilares deben llenarse dos terceras partes y sellarse con la llama de un mechero, el extremo vacio
Se centrifuga con el extremo sellado colocado hacia afuera de la centrífuga, equilibrando los tubos
Centrifugar los tubos a 12,000 rpm por espacio de 5 minutos
Leer en el lector de microhematocrito ambos tubos

Valores de referencia:

Hombre de 45 a 50%

Mujeres de 42 a 46%

Interpretacion de resultados:

Los resultados expresados en milimetros por ciento, cantidades menores de los valores de referencia, no son aceptados como disponentes.

Practica No 9

Investigacion de Serolues

Objetivo: El alumno detectará anticuerpos dirigidos contral el treponema pallidum, anticuerpos no treponémicos por medio de la técnica adecuada.

Generalidades: Sífilis es una de las principales enfermedades de transmisión sexual (ETS), puede transmitirse por la sangre de una transfusión por lo que es indispensable en el estudio del disponente, en ocasiones el donante niega todo antecedente de esta enfermedad y el exámen físico no revela datos sospechosos, el estudio serológico de los probables disponentes deben hacerse de rutina, se ha comprobado que la sangre refrigerada a 4°C por un lapso mayor de 3 días, mata los treponemas que pudiera contener, no transmite la enfermedad pero sí las reaginas específicas, por lo que las reacciones serológicas del receptor de sangre, se vuelven positivas en forma temporal.

Las reaginas es el anticuerpo inmune contra la sífilis, apa recen en la sangre y liquido cefaloraquideo de personas que padecen la enfermedad: las reaginas también se encuentran en enfermedades producidas por treponemas, como son la lepra y el mal del pinto.

La sífilis es producida por una espiroqueta patógena, el treponema pallidum, bacteria gram negativa, anaerobia estricta, que mide de 6 a 15 micras de largo y de 0.1 a 0.2 micras de ancho, es una enfermedad infecciosa que puede presentarse en forma aguda y evolucionar a estados crónicos las manifestaciones clnicas, cuando están presentes, son diversas; varian dependiendo de la etapa en que se encuentre la infección, así como de la respuesta individual del paciente.

Procedimientos de laboratorio: Diversos recursos tiene el laboratorio clínico para la investigación de sífilis:

Ø Microscopia en campo obscuro de exudado de lesión,
Ø Investigación de Anticuerpos Antitreponémicos con:
Ø Tecnica de inmunofluorescencia indirecta
Ø Tecnica de hemaglutinación indirecta.
Ø Tecnica de inmovilización de treponemas.
Ø Investigación serológica de Anticuerpos inespecificos con ensayos no treponémicos VDRL O RPR por su facilidad de adquirir los reactivos y simplicidad en la técnica, se utilizan rutinariamente en el laboratorio las pruebas no treponémicas, las cuales se hacen positivas alrededor de la cuarta a la sexta semana despues del contacto infectante.

Fundamento: Método que emplea antígeno de cardiolipina, derivado del corazón de bovino para la detección de Anticuerpos totales denominados reaginas, estos son formados por el organismo en respuesta al material lipídeo, que se libera de las células dañadas durante la infección, así como en contra del lípido presente en la superficie de los treponemas, el antgeno es una suspensión de lecitina colesterol en solución salina de pH estabilizado, que se añade al suero del paciente inactivado en baño maría a56°C por 30 minutos, la reacción amtigeno anticuerpo se observa por floculación, que es suficiente para estandarizar su reactividad.

Material y equipo:

Ø 1 placa de vidrio escavada,
Ø 2 pipetas de 1 ml o pipeta automatica de 50 mcl
Ø 1 centrifuga clínica
Ø 1 baño maria a 56°C
Ø 1 equipo para prueba de VDRL
Ø Suero problema, no hemolizado
1 agitador de placa
1 Microscopio

Tecnica:

El suero probema se inactiva, calentándolo durante 30minutos a 56°C en baño maria
Se prepara el antígeno cuidadosamente como indica el instructivo
Colocar una gota de suero inactivado en la placa de vidrio escavado y una gota del antígeno preparado
Agitar durante 4 minutos para procurar una mezcla homoge na
Observar al microscopio con ocular 100x y objetivo 10x

Interpretacion de resultados:

Ø Negativo si no presenta grumos.
Ø Debilmente positivo si hay grumos pequeños
Ø Positivo si los grumos son de tamaño mediano y grande
Ø Obervacion el banco de sangre, solo utilizará sueros negativos, pero si se presentan resultados débilmente positivos o positivos, podrá realizarse la prueba cuantitativa y enviar al donante con el servicio médico, para investigación y tratamiento si es necesario.

R. P. R.

Generalidades: Llamada prueba rápida de reagina plasmática, es un método confiahle, si el resultado es negativo, se puede obtener la donación; si es positivo se necesita un análisis de comprobación que puede ser cualquiera de los enunciados anteriormente, los fabricantes presentan en una sola caja el equipo necesario que contiene el reactivo por emplear, tarjetas de cartulina siliconada, popotes de plastico para medir la cantidad adecuada de suero o plasma.

El reactivo tiene el VDRL, adicionado de cloruro de colina que sirve para hacer una descomplementación química y un marca dor de carbón en partículas muy finas que dan color negro o rojo, a las reacciones de aglutinación, las reacciones negativas tienen aspecto uniforme el R P R presenta un reactivo esteril y listo para usarse, los equipos contienen además sueros control de reactividad específica: reactivos, debilmente reactivos y no reac tivos.

Tecnica:

Coloque en una tarjeta del equipo una gota del suero o plasma del paciente con el popote de plastico.
Extienda la muestra por todo el circulo con la ayuda de la punta del popote, sin permitir que el suero se salga de la onlla del circulo
Sostenga la suspensión del antígeno, coloque el dispositivo goteador en posición vertical y agrege exactamente una gotade la suspensión al suero o plasma en el area de la prueba
Coloque la tarjeta en un rotador mecánico durante 8 minutos a velocidad 100 rpm para una mezcla homogénea

Interpretacion de resultados

Ø Negativo mezcla homogéna
Ø Positiva aglutinación acentuada con grumos negros o rojos,

Observaciones:

Es conveniente montar simultaneamente un control positivo y negativo junto con el problema.

Al finalizar cada determinación, quite la aguja de la suspensión de antígeno, lave con agua destilada, seque al aire, tape el recipiente y refrigere hasta que de nuevo sea empleado.

Practica No. 10

Hepatitis

Objetivo: Detectar anticuerpos contra el virus de la hepatitis «B» en el suero humano.

Generalidades: Debido al incremento de la aparición de la hepatitis, desde el año de 1972, se ha vuelto obligatorio en el Banco de Sagre, la investigación en detectar el antígeno de superficie de la hepatitis “B” en la sangre de los posibles donadores de sangre.

Exisen diversos métodos para la investigación del antígeno de superficie y se han clasificado según su sensibilidad, referida refida a un panel de sueros conocidos que contienen antígenos. De estos tenemos las pruebas de primera generación, las menos sensibles, porque solo detectan sueros de más potente reactividad como en el caso de difusión en gel simple, las pruebas de segunda generación, como la contraelectroforesis ya algo más sensibles y las pruebas de tercera generación, con sensibilización suficiente como para detectar todos los sueros reactivos: actualmente se tienen cuatro tipos de pruebas de tercera generación.

Radioinmuno ensayo RIA
Hemaglutinación pasiva inversa
Aglutinación pasiva inversa con látex capilar
Análisis de inmunoabsorción enzimática ELISA

Radioinmundensayo:

En el cual se utilizan esferas de plástico cubiertas con Anti HB, cada suero problema se incuba junto con una de estas esferas durante el tiempo de incubación si hay HB ag en el suero, el suero problema reacciona con el Anticuerpo y cubre la esfera esta se lava y se añade Anti HB marcado con, si la prueba es positiva, el anticuerpo radiactivo reacciona con el antígeno previamente ligado y midiéndose el resultado con un contador de radiaciones gamma, este método es muy sensible y específico.

Hay que tomar las precauciones adecuadas para la conservación de las soluciones radiactivas, los materiales sólidos, esferas, placas y tubos contaminados con radiactividad, deben desecharse siguiendo las normas de la Comisión de Energia Atómica.

Hemaglutinacion Pasiva Inversa

Este método utiliza antígenos ligados al eritrocito la prueba se denomina inversa poeque el anticuerpo se une a eritrocitos estabilizados congelados y desecados la prueba del examen selectivo se lleva a cabo en placas de microtitulación, las diluciones de cada suero problema y los sueros de control se introducen en pozos en forma de V, una gota de eritrocitos cubiertos con Anti HBS se añade a cada uno de estos, después de un periodo de incubación sin agitarlos, se lee la posi tividad o negatividad de los resultados, las cuales dependen de la forma de sedimentación de los eritrocitos en el pozo si elresultado es positivo, la aglutinación de los eritrocitos es más difuso que en las reacciones negativas, todos los sueros positivos deben confirmarse. La prueba es subjetiva, ya que la persona que realiza lalectura debe decidir sobre la positividad o negatividad de los re sultados

Aglutinacion Pasiva con Latex.

Los sueros se absorben con partículas de látex cubiertas con globulina gamma de cobayo, los sueros absorbidos se incuban con partículas de látex cubiertas con antiHBS mientras se hacen rotar las muestras, la lectura es igual para la de hemaglutinación pasiva inversa.

Analisis de Inmunoabsorcion Enzimatica prueba de ELISA:

El método de ELISA es similar al RIA pero en vez de utilizar antiHBS marcado con 1125, se emplea un antiHBS marcado con una enzima después de la incubación y el lavado se añade un sustrato para inducir un cambio de color si se ha ligado el complejo enzima antiHBS los resultados se leen en un espextrofotómetro para medir la densidad del color. Este método tiene gran sensibilidad y especificidad, además de que la lectura es objetiva; puede utilizarse un tipo de lectura automatizada para leer e imprimir los resultadosnaturalmente su precio los hace prohibitivos, todos los métodos de tercera generación pueden detectar partículas de un ng/ml.

En la utilización de las técnicas anteriores, es preciso los cuidados máximos de limpieza y condiciones sanitarias, la zona para las pruebas de hapatitis deben estar separada del resto del banco de sangre y el personal debe utilizar mascarillas, anteojos y guantes desechables, tratar los materiales como si fueran capaces de transmitir agentes infecciosos.

Practica No. 11

Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida «SIDA»

Objetivo: Busqueda de los antígenos virales o anticuerpos producidos como respuesta a los antígenos, en suero sanguíneo de una per sona infectada por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) .

Generalidades: El sindrome de la inmunodeficiencia adquirida (SIDA) conocido también como “AIDS» las iniciales de su nombre en ingles (adquiréd inmunodeficiency síndrome) es considerado en practicamente todos los paises del mundo como un serio problema de sa lud publica.

El agente causal del SIDA es un retrovirus que fué denominado «limphadenopaty asociated virus» por su primer descubridor, el Dr Luc Montagnier, del instituto Pasteur en Francia, en mayo de 1983. En mayo de 1984 el Dr Robert Gallo del Instituto Nacional del Cancer en U S A, aisla y caracteriza un retrovirus de pacientes con SIDA y lo denomina «human ymphotropic virus III desde 1987, por acuerdo internacional se decide nombrar al virus «human inmunodeficiency virus» (HIV en español «virus de la inmunodeficiencia humana” hasta el momento se han reconocido dos cepas significativamente diferentes, llamandoles VIH I y VIH 2, el virus se transmite por contacto sexual, bucal o anal por la inoculación o administración de sangre o hemoderviados contaminados y perinatalmente de madre infectada a hijo; el paso trasplacentario del virus está demostrado y existe la factibilidad de infección a través de la lactancia.

No existen evidencias que apoyen la transmisión por contacto casual entre las personas en ambientes escolares, sociales o de trabajo; no existe la evidencia de la transmisión por medio de insectos, ni por tos o estornudos, asi como tampoco a través de agua o alimentos.

Después de infectarse una persona, puede permanecer asintomática durante varios años algunos pacientes pasan por un estadío de molestias tempranas con presencia de fiebre, artralgias y malestar general que se presentan al mismo tiempo que la seroconversión, momento a partir del cual es posible detectar anticuerpos contra VIH en el suero del paciente esto ocurre generalmente entre la segunda semana y el tercer mes posterior a la infección, a partir de este momento pueden pasar en promedio de 8 a 9 años para el de sarrollo del SIDA,una vez que la enfermedad se ha desarrollado, la mortalidad es muy elevada, casi del 100%.

El virus es capaz de producir el deterioro progresivo y predecible de las funciones inmunologicas, siendo el SIDA una manifes tación tardía de este proceso, el padecimiento es de naturaleza inmunosupresora y de tipo basicamente celular, la población celular especificamente abatida, es la de los linfocitos T cooperador C4, la perdida de las celulas T4 daña seriamente la habilidad del organismo para contrarrestar a la mayor parte de microorganismos invasores, observando que este daño es particularmente severo, sobre la defensa en contra de virus, hongos, parasitos y ciertas bacterías.

Metodos de laboratorio: Una vez que la infección ha ocurrido, el individuo podra permanecer totalmente asintomatico durante un lapso que puede fluctuar desde 10 meses hasta 89 años, un individuo infectado o infectante por el hecho de sentirse bien, continuará su conducta habitual, con el consiguiente riesgo para si y para los demas, dentro de este lapso asintomatico, la unica manera de conocer si una persona está o no infectada, es mediante la busqueda de los antígenos virales a los anticuerpos producidos en respuesta a aquellos, en suero sanguineo o bien el aislamiento del virus a partir de algún tejido, las pruebas de laboratorios que se disponen son las que permiten detectar aticuerpos contra VIH y se dividen en dos categorias:

Prueba de tamizaje o escrutinio inicial (presuntivas)
Pruebas confirmatorias

Pruehas presuntivas:

Actualmente existen varias pruebas para la detección de aticuerpos contra VIH estas pruebas difieren en suprincipio funcional, lo cual da lugar a diferencias en tiempo de proceso, necesidad de instrumentación analítica, necesidad de adies tramiento y experiencias del personal analista, entre otras, ELISA (Eenzyme Linked Inmuno Sorbent Assay)

Fundamento: Se trata de un análisis inmunoenzimatico heterogéneo, existen dos tipos competitivo y no competitivo, emplean una fase sólida la cual ha sido recubierta con antgenos de VIH si el suero problema contiene anticuerpos contra VIH, estos reaccionan con el antgeno quedando por lo tanto unidos a la fase sólida, el revelado de la presencia de estos anticuerpos unidos se hace medianteun conjugado formado por un anticuerpo Anti IgG o Anti IgM unido a una enzima, la unión del conjugado se pone de manifiesto adicionando el substrato de la enzima, en los ELISA de tipo no competitivo, la producción de color es directamente proporcional a la cantidad de anticuerpos contra VIH presentes en el suero problema, dentro de ciertos lmites, enlos ELISA de tipo competitivo, la producción de color es inversamente proporcional.

Material requerido:

Ø Micropipetas
Ø Sistema de lavado de pozos
Ø Espectofotómetro para placas de Elisa
Ø Tiempo de proceso:
Ø Elisa competitivo: Aproximadamente 2, 5
Ø Elisa no competitivo: Aproximadamente 4
Ø Elisa rapido: Aproximadamente 15 minutos

Aglutinación:

Fundamento: Estos métodos hace uso de particulas, ya sea de látex, gelatina o bien hematies, sensibilizados con antígeno de VIH, el contacto con un suero que contenga anticuerpos contra VIH produce la aglutinación indirecta de las partículas, observable a simple vista.

Material:

Todo el material viene con el equipo de reactivos

Tiempo de proceso:

Latex 5 minutos

Gelatina 2 horas

Hematíes 2 a 3 horas.

Citoinmunoenzimatica.

Fundamento:

Este método emplea células infectada con VIH, colocadas en un pozo de un porta objetos, al reaccionar con un suero quecontenga anticuerpos contra VIH estos se uniran a los antgenos de VIH presentes en las células, dicha unión se pone de manifiesto mediante un conjugado de proteina «A» estafilococica y el substrato correspondiente, produciendose coloración de la membrana y citoplasma celular.

Material:

Ø Micropipetas
Ø Microscopio
Ø Tiempo de proceso: 2 horas

Membrana sensibiltzada.

Fundamento: Eeste análisis hace uso de una membtana porosa sensibilizada con antígenos de VIH, al depositar el suero problema sobre la membrana, la reacción ocurre instantaneamente, drenandose rápidamente el líquido los anticuerpos unidos se ponen de rnanifiesto mediante un conjugado especial que provoca la aparición de un punto rojo apreciable a simple vista.

Material: ninguno.

Tiempo de proceso: 5 minutos.

De los metodos mencionados, el más ampliamente utilizado es el ELISA, muy confiable y razonablemente rápido. Los métodos de aglutinación, en general pueden ser considerados como una buena alternativa sobre todo aquellos cuyos resultados se obtienen en pocos minutos, sin embargo, todos ellos quedan sujetos a la objetividad de la lectura visual del resultado, particularmente al tratarse de un suero debilmente positivo.

En todos los casos de pruebas presuntivas, un primer resulta dopositivo deberá verificarse repitiendo el analisis con los mismos reactivos o preferentemente con reactivos de otro tipo. Resultados repetidamente positivos en pruebas de esta calidad, deberán calificarse como presuntivamente positivos y procederse a su confirmación mediante los metodos correspondientes.

Existe también un ELISA que permite detectar las proteinas constitutivas del VIH (antigenemia) esta prueba es útil en la detección muy temprana de la infección (2-4 semanas después del contagio), cuando aun no es posible detectar anticuerpos circulantes.

Pruebas confirmatorias actualmente en uso son:

Ø Western Blot o Inmunoelectrotransferencia
Ø Inmunofluorescencia
Ø Radio-inmuno-precipitacion

Wester Bloto o Inmuno electro transferencia.

Método que hace uso de tiras de papel, las cuales han sido impregnadas con las diferentes proteinas constitutivas del virus, mediante un proceso previo de inmunoelectrotransferencia. Las proteinas se encuentran distribuidas a lo largo de la tira de papel en orden decreciente de peso molecular, en espacios discretos y bien definidos.

La tira asi preparada se coloca en un canal de plastico y se sumerge en una dilución del suero problema; en caso de existir anticuerpos contra VIH, estos se unirán a la tira de papel en el punto correspondiente a la localización de la proteina para la cual sean especificos. Tal unión se pondrá de manifiesto mediante un conjugado enzimático Anti-inmunoglobulínico y el substrato correspondiente, que dará lugar a la aparición de bandas obscuras sobre la tira.

Este método permite detectar la presencia de anticuerpos especificos contra las siguientes proteinas de VIH; gp160, gpl20, p55 p51, gp41, p31, p24 y p217, se han utilizado varios criterios de interpretación de la lectura de las tiras, los dos más usuales son:

Interpretacion Criterio 1 Criterio 2

Ø Negativo Ausencia total de bandas
Ø Indeterminado Presencia de bandas que

No cumplen con el

criterio de positividad

Ø Positivo Al menos 1 banda Aparición de la

Correspondiente a c/uno Banda gp160 y al

De los 3 genes principales menos una GAG o de VIH (ENV, GAG,)

Atualmente se cuenta con reactivs comercialmente disponibles tanto para VIH 1, como para VIH 2.

Inmunofluorescencia

Este método consiste en utilizar células infectadas por VIH depositadas en pozos de un porta objeto, el suero problema se coloca encima de un pozo con células infectadas y de otro con células no infectadas, en caso de tener anticuerpos específicos contra el VIH, estos se uniran a las células infectadas, mientras que las no infectadas no presentaran unión alguna, la reacción antigeno-anticuerpo se pone de manifiesto por medio de un Antisuero Anti inmunoglobulínico conjugado con fluoresceina, al ser observado en un microscopio de fluorescencia.

El criterio de asignación de positividad, estará dado por la presencia de un patrón de fluroescencia periférico (de membrana característico) y ocasionalmente por cierto patrón citoplásmico, si bien este método es considerado de calidad confirmatoria, es menos sensible que el Western Blot, esta técnica aunque sencilla presenta problemas de interpretación, por lo que solo puede ser realizada por técnico altamente capacitados.

Recomendaciones para el personal de laboratorio.

Por el trabajo que se realize en el laboratorio, el personal que se desempeña en el mismo, corre un riesgo al estar en contacto con sangre, secresiones, así como con agujas e instrumentos contaminados con sangre de personas en riesgo de infección por SIDA, ya hemos puntualizado que el riesgo de transmisión ocupacional es muy bajo, y ha sucedido que personal que labora en el laboratorio, la exposición parenteral a sangre contaminada, pocos casos se han reportado y demostrado seroconversión para el VIH.

No se ha demostrado la contaminación en los lugares de trabajo por contacto fortuito a través de agua o alimentos contaminados, insectos que actuan como vectores o por via aerógena el personal de laboratorio, así como los que manejan y atienden a pacientes, se deben tomar y extremar precauciones para evitar el contacto directo con la piel o las mucosas con sangre, hemoderivados, excresiones, secresiones y tejidos de pacientes con SIDA o de personas con infección presumible del padecimiento.

Todo el personal de salud, incluso estudiantes, que se encuentran dentro de instalaciones hospitalarias, debe conocer la epidemiologia, manifestaciones clínicas, forma de transmisión y precauciones para prevenir la contaminación de la infección del SIDA.

Precauciones: Deben aplicarse en los laboratorios clínicos, como los de investigación; se puntualiza en el personal que efectúa estudios con especímenes u otros materiales potencialmente infectados cultivos tisulares inoculados, huevos embrionados o tejidos animales procedente de individuos con sospecha o certeza de VIH.

En el laboratorio se utilizarán pipetas mecánicas para el transvase de todos los líquidos no se permitirá el pipeteo con la boca. Las agujas y jeringas que se utilicen serán desechables y una vez utilizadas se colocaran en recipientes irrompibles de boca ancha, no deben taparse con su guarda para prevenir pinchazos, ni se doblaran, romperan o desacoplarse de la jeringa, se incinerará

el recipiente.

Debe usarse bata o uniforme de laboratorio, de manga larga. Se utilizarán guantes para evitar el contacto de la piel con la sangre, muestras que contienen sangre, articulos contaminados con sangre, líquidos corporales, excresiones y secresiones, así como superficies, materiales u objetos expuestos a ellos.

El material potencialmente infeccioso debe tratarse y ma nipularse cuidadosamente para reducir al mínimo la formación de aerosoles. Se recomienda usar cabinas de seguridad biológica y otros dispositivos de contención primaria por ejemplo cubierta de seguridad para la centrífuga.

Cuando se realizan procedimientos de general aerosoles como en el caso de centrifugación, mezclas, aplicación de ultrasonido, mezclas vigorosas y obtención de tejidos infectados de animales o huevos embrionados.

Después de cualquier salpicadura de material que pueda ser infeccioso y al terminar la jornada, las superficies de trabajo de las mesas de laboratorios, se limpiarán con un desinfectante como la solución de hipoclorito de sodio (dilución de 1:1 en agua fria). Ttodos los materiales potencialmente contaminados que seanutilizados en las pruebas de laboratorio se estetilizaran en autoclave, antes de desecharlos o reutilizarlos.

El personal no debe tomar alimentos ni fumar dentro del laboratorio. El personal debe lavarse las manos con agua y jabon después de quitarse los guantes y quitarse la bata antes de salirdel laboratorio. Comentario adicional se recomienda a laboratorios y bancos de sangre, a el personal se le practique, semestralmente investigación de Hepatitis B y VIH

Practica No. 12

Investigación Individuo Secretor.

Objetivo Obtener una saliva de individuo secretor.

Fundamento: Si a un suero para diagnóstico anti A se le agrega saliva secretora tipo A, se neutralizarán sus aglutininas inactivando el reactivo, que ya no podrá aglutinar glóbulos rojos A o B.

Material y equipo:

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos 10 x 75
Ø 6 Tubos 13 x 100
Ø 1 pinza para tubo de ensaye
Ø 1 vaso de precipitado de 100 ml
Ø 1 pipeta graduada 5 ml
Ø 4 pipetas Pasteur c/bulbo
Ø 1 mechero Bunsen
Ø 1 tripie
Ø 1 tela de alambre
Ø 2 centrifugas Serofuge
Ø Solución salina en pizetas
Ø Sueros anti A
Ø Suero anti B

Técnica:

Se obtiene saliva de una persona de tiro A conocidas y otra de tipo B colocando una torunda de algodón debajo de la lengua, después se exprime en un tubo de ensayo colectar 3 ml

2 En un vaso de precipitados se calienta la saliva a 56°C durante 5 minutos, después se centrifuga a 2500 r, p m, durante 5 minutos y se cosecha el sobrenadante,

3 Para investigar si ésta saliva es o no secretora de la sustancia de grupo sanguíneo se procede así:

En un tubo de ensayo de 10 x 75 se ponen 4 gotas de saliva a estudiar y se agrega una gota de suero anti A , (mezclar, dejar a temperatura ambiente, durante 15 minutos.
Preparar un testigo positivo, con cuatro gotas de salina y una gota del mismo suero anti-A.
Agregar a cada tubo una gota de glóbulos a conocidos, mezdar bien esperar 3 minutos y centrifugar 2500 rpm, buscando aglutinación

Interpretación de resultados:

1 El testigo deberá ser aglutinado siempre

2 El problema puede comportarse en dos formas:

a) Si no presenta aglutinación es que la saliva estudiada es secretora y por ello ha neutralizado las aglutininas

b) Si la saliva estudiada presenta aglutinación, no es secretora

Practica No. 13

Pruebas Cruzadas de Compatibilidad Sanguinea

Objetivo: El alumno al finalizar la práctica determinará si dos sangres; del donador y del receptor, son compatibles, para practicar la transfusión sanguínea.

Generalidades: En todo banco de sangre y ante la inminencia de transfundir sangre a un individuo, es obligatorio efectuar la determinación del tipo sanguíneo y el factor Rh del receptor; al seleccionar la sangre a transfundir, deberá ser del mismo tipo sanguíneo y factor Rh del paciente, cumpliendo con esta premisa, se efectuará en el laboratorio un análisis que nos permita en “vitro” detectar si en ellas, tenga un anticuerpo anormal, que pueda causar aglutinación o hemólisis de los glóbulos rojos en la circulación sanguínea del receptor. La identificación correcta de la sangre elegida para la donación, la del paciente que ha de recibir la transfusión, la exactitud, velocidad, prevención y de control de calidad y omisión de errores, son aspectos que al realizar las pruebas cruzadas, revisten gran importancia, pues errores humanos descubiertos después de iniciada una transfusión son imposibles de corregir y ponen en peligro la vida del paciente.

Fundamento: Las pruebas cruzadas deben:

a) Detectar anticuerpos IgM de carácter aglutinante o hemolizante que fijan complemento, por lo que se debe trabajar con sangre recién extraidas y coaguladas.

b) Investigar Anticuerpos IgG que por su naturaleza no producen aglutinación y se deben utilizar distintos «medios« que permitan demostrar su presencia, produciendo aglutinación o hemólisis.

Material y equipo:

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos 13x 100
Ø 12 tubos 10 x 75
Ø 6 pipetas Pasteur con bulbo
Ø 2 centrifugas Serofuge
Ø Baño maría a 37°C
Ø Sólucion salina en pizetas
Ø Albúmina bovina al 22%
Ø Suero Antiglobulina Humana (Coombs)

Técnica:

Separar los sueros de los globulos rojos
Realizar una suspensión de globulos rojos del disponente y del receptor al 5% previamente lavados
Se colocan 7 tubos en línea recta y se marcan:

1 2 3 4 5 6 7

E r Sr Ed Sd FM fm C

A la Fase mayor se le pone una gota de suero del receptor más una gota de globulos rojos al 5% del disponente
A la fase menor se le pone una gota de suero del disponente más una gota de globulos rojos al 5% del receptor
Al tubo control se le pone una gota de suero del receptor más una gota de globulos rojos al 5% del receptor
Se centrifugan a 2500 rpm por 30″ y se lee desprendiendo suavemente el sedimento en busca de aglutinacion de no existir aglutinación, se continuará
Se agregan dos gotas de Albúmina Bovina al 22% y se centrifuga a 2500 rpm por 30″ y se lee
Se incuban a 37°C durante 30 minutos, se extrae los tubos

10.Se centrifuga a 2500 rpm por 30″ y se leen

11.Se llenan con solución salina 3/4 de ambos tubos (fase mayor y menor) se mezclan y se centrifugan a 2500 rpm por 30″, se sacan de la centrífuga y se decantan y se vuelve a aplicar solución salina (ésta operación se repite tres veces) en el último lavado, se decantan completamente el tubo

12.Al sedimento residual se le agregan dos gotas de reactivo de Coombs a ambos tubos y se centrifugan a 2500 rpm por 30″, se leen cuidadosamente para buscar que no haya hemólisis ni aglutinación

13.Se le agrega a cada tubo una gota de células control se centrifuga a 2500 rpm por 30″ y se leen en busca de aglutinación.

Conclusión:

Ø La prueba mayor, menor y control contienen:
Ø Prueba mayor: suero del receptor con globulos rojos del disponente (2 gotas de suero del receptor más 1 gota de suspención de eritrocitos del disponente)
Ø Prueba menor: suero del disponente con globulos rojos del receptor (2 gotas de suero del disponente más 1 gota de suspención de eritrocitos del receptor)
Ø Control: suero del recpetor y globulos rojos del receptor (2 gotas del suero del receptor más 1 gota de suspención de e ritrocitos del receptor )
Ø Si en todos los pasos no existió aglutinación o hemólisis, las pruebas son 100% compatibles y la sangre puede transfundirse, en caso de existir aglutinación o hemólisis, en cualquiera de los pasos se considera incompatibilidad, las pruebas se suspenden y se comienza a investigar otra bolsa de sangre del mismo tipo sanguíneo y factor Rh, siguiendo los mismos pasos.
Ø Si la incompatibi lidad, se encuentra en los tubos con salina (1 y 2) probablemente se trata de una IgM y hay una equivocación en el tipo sanguíneo, por lo tanto se debe ratificar el tipo del donador.
Ø Si la aglutina ción es en el tubo menor en salina se trata de una IgM del donante y es de esperarse, en el caso de emplearse sangre «O».
Ø Cuandose efectua el cruce con receptores de tipo sanguneo distinto esta sangre puede emplearse, de preferencia el paquete globular. Es de hacerse notar que tanto la aglutinación como la hemólisis son macroscópicas y que en muy pocos casos es necesario utilizar el microscopio.

Este método por los numerosos pasos que hay que efectuar, al parecer es complicado, pero la práctica continua del mismo se vuelve simple y automatizado y en muchas ocasiones de acuerdo con la urgencia se puede reducir la incubación, con primera lectura a los 20 minutos, si se reporta negativo, enviar la sangre a transfundir, continuando con el método hasta cumplir con los tiempos señalados.

Las investigaciones de métodos más sencillos y gran confiabilidad, han llevado a buscar que la velocidad de algunas reacciones antígeno anticuerpo de grupos sanguíneos, aumentan considerablemente si la incubación se lleva a cabo en condiciones de ba ja fuerza iónica entre sus ventajas, se encuentra el acortamiento de los tiempos de incubación, la posibilidad de detectar algunos anticuerpos débiles que no pueden detectarse por otros métodos y la formación de aglutinados más fuertes que los producidos por otras técnicas en la fase de Antiglobulina, aumentan un tanto las reacciones débiles, probablemente debido a la unión inespecifica de los componentes del complemento. Los reactivos que han de utilizarse en las técnicas deben prepararse y controlarse con esmero, y las condiciones de las reacciones deben ser tan precisas para evitar resultados positivos falsos no cabe duda de que los métodos con LISS, si se efectuan adecuadamente son excelentes, siempre y cuando lo empleen pesonal debidamente entrenados este recurso no es de uso común y su uso está restringido a muy pocos centros especializados.

Interpretación de Resultados

Ø Para el corrector manejo de los resultados se deberá anotar después de cada observación

Ø Aglutinación en cualquiera de las pruebas mayores no sera necesario proseguir con los siguientes pasos, pués demuestra in compatibilidad

Ø Las anotaciones se pueden realizar en tarjetas diseñadas exprofeso y de las cuales cada laboratorio contará con un modelo, cualquiera que éste sea debe contener los datos generales, de receptor y donador, cada tarjeta debe ser adherida a la bolsa de sangre correspondiente y al enviarse a la aplicación del paciente, se guardará en el expediente del mismo.

Practica No. 14

Prueba de Coombs

Objetivo: El alumno conocerá los eritrocitos sensibilizados por anticuerpos incompletos, que son capaces de ser aglutinados por la Antiglobulina Humana.

Generalidades: El suero de Coombs permite establecer la presencia de globulina y por lo tanto de anticuerpos, ya que son de la mismanaturaleza, los anticuerpos incompletos como son los que producen la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se absorben sobre la superficie del glóbulo rojo; pero no los aglutinan, el suero Antiglobulina permite reconocer estos glóbulos sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulínicos que ya cubren.

Es util reconocer estos globu1os sensibilizados al combinarse con los anticuerpos globulínicos que ya cubren su superficie el suero de coombs es ideal pués tiene anticuerpos contra las globulinas séricas humanas que abarcan cuatro grandes alfa1, alfa2, beta y gamma, y dentro de estos grupos se en cuentran anticuerpos Anti Rh incompletos, Anti-Duffi, Anti Kell el suero de Coombs se obtiene por inyecciones repetidas de sueros humanos del grupo «O» a conejos el animal sensibilizado de esta manera produce anticuerpos contra la fracción globulinica de las proteinas séricas y contra anticuerpos incompletos que pueden encontrarse revistiendo a los hematíes o bien es suspensión en el plasma, por lo que se llama Antiglobulina Humana, se preparan reactivos de amplio espectro mediante la mezcla de sueros obtenidos de distintos animales.

La IgG no produce aglutinación de los eritrocitos, pero se fijan sobre ellos y permanecen sin soltarse, al agregar el suero de Coombs se forman puentes entre los fragmentos cercanos y es posible ver la aglutinación, revelando que esos eritrocitos estaban en realidad cubiertos de anticuerpos.

Prueba de Coombs Directa.

Fundamento: La prueba directa se realiza cuando el Antiuerpo se ha fijado sobre el eritrocito «in vivo”, permite establecer la sensibilizaci6n de los glóbulos rojos que tuvo lugar en el organismo. Se usa para el diagnóstico de eritroblastosis fetal, anemia hemolítica y reacciones hemolíticas postrasfusionales por sangre incompatible

Material y equipo

Ø 1 gradilla
Ø 4 tubos de 13 x 100
Ø 2 tubos de 10 x 75
Ø 2 pipetas Pasteur c/bulbo
Ø 1 centrifuga Serofuge
Ø 1 baño maría 37°C
Ø Solución salina en pizetas
Ø Suero de coombs
Ø Globulos rojos problema
Ø Globulos rojos «O» Rh negativos

Tecnica

Para identificar los glóbulos rojos sensibilizados es necesario remover la totalidad del suero de los eritrocitos, mediante lavadas repetidas con suero salino. Este proceso es importante, pués si se dejan residuos proteicos se neutraliza el suero de Coombs y se obtendrán falsos negativos
Se prepara una suspensión de glóbulos rojos al 5% de lacuál se colocan dos gotas en un tubo de ensaye y se procede al lavado por tres ocasiones
Después del último lavado se resuspenden los glóbulos rojos nuevamente con una gota de solución salina, agregar dos gotasde suero de coombs y mezclar
Incubar por 30 minutos a 37°C, extraer el tubo cuidadosamente y observar si existe aglutinación en el fondo del tubo con leves movimientos de inclinación,
Se aconseja como testigo utilizar hematíes de adulto no sensibilizados del mismo grupo del paciente. El testigo se prepara en un tubo poniendo una gota de sangre “O” Rh negativa y cuatro gotas de solución salina más una gota de suero anti Rh, incubar media hora, lavar por tres veces estos glóbulos y después se adiciona una gota de suero de Coombs

Interpretacion de resultados:

La aglutinación en el tubo testigo no debe existir,
Si el tubo problema presenta aglutinación, los glóbulosrojos están sensibilizados por algún anticuerpo incompleto

Prueba de Coombs Indirecta

Fundamento: En esta prueba la sensibilización se realiza in vitro, en la primera etapa se sensibilizan los glóbulos rojos testigos con el anticuerpo que se desea investigar (Rh negativo, factor Kell, Diego, etc.) y en la segunda etapa por medio de reactivo de Coombs se hace visible la sensibilización por medio del fenómeno de aglutinación macroscópica.

Técnica

En tubo poner cuatro gotas del suero promema y una gotade glóbulos rojos sensibilizados, suspendidos en solución salina al 5%, si se investigan anticuerpos Rh se usan glóbulos rojos tipo”O” Rh positivos
Se incuba a 37°C por una hora, se centrifuga el tubo a baja velocidad 2500 rpm x 1 minuto
Se lavan los glóbulos rojos sensibilizados tres veces con solución salina, desechando el sobrenadante completamente en el último lavado, dejando solo el boton de eritrocitos en el fondo
Agregar dos gotas de suero de Coombs, mezclar perfectamente y poner en baño María a 37°C, durante cinco minutos,
Centrifugar a baja velocidad 2500 rpm y buscar aglutinación en el fondo del tubo

Interpretacion de resultados.

Si se encontró aglutinación después del paso número 2, indica la presencia de aglutininas anti Rh en el suero problema
Si la prueba es negativa, se puede presumir la existencia de anticuerpos incompletos o bloqueadores, y se comprueba prosiguiendo con la técnica.
Se puede realizar diluciones del suero problema para conocer el titulo del aglutininas anti-Rh que existen en el paciente

Practica No. 15

Investjgacion con Celulas Control de Coombs en la Prueba Cruzada Pretransfusional

Objetivo: Que el alumno aprenda a fijar un anticuerpo en la membrana del eritrocito. Al utilizar estos eritrocitos sensibilizados en las pruebas cruzadas que hayan resultado compatibles, convertirá una prueba negativa en positiva.

Fundamento. En esta prueba se fija sobre el determinante Antigénico de eritrocitos “O”, anticuerpo (anti-D). Estos eritrocitos al encontrarse en un medio con reactivo de Coombs, este forma un puente entre los eritrocitos cercanos, produciendo aglutinación.

Generalidades. Esta prueba fué descrita por primera vez en 1908 por Mc. Reschi y años más tarde en 1945 por Coombs, Mourat y Race, aplicándola en la identificación de aglutininas Rh debiles e incompletas. El suero de coombs es una Antiglobulina Humana, preparada por inmunización de animales (conejos o cabras a los que se les inyecta suero humano o las fracciones de éste, los anticuerpos incompletos, entre ellos los que explican la eritroblastosis fetal y la anemia hemolítica adquirida, se adsorbe o se une al antígeno Rh fijos en la membrana del eritrocito, pero no los aglutina, el suero Antiglobulina Humana, permite reconocer estos glóbulos sensibilizados, al combinarse con los anticuerpos incompletos que ya cubren en superficie con lo cual se produce la aglutinación.

Puesto que el suero humano contiene anticuerpos que pueden interferir en la prueba y puede neutralizar el suero de Coombs, es necesario eliminar totalmente el suero de la muestra sanguínea, mediante lavados repetidos con solución salina.

No se utilizan los sueros de sujetos “A” o “B” porque las substancias especficas de estos, tendrían suero de Coombs con anticuerpos contra las aglutininas a y b, los anticuerpos recubren con frecuencia los eritrocitos, pero no forman la malla necesaria que produce la aglutinación; como es el caso de anticuerpos dirigidos a los determinantes Rh sobre los eritrocitos humanos sin embargo la adicición de un antisuero Antiglobulina producido por una especi heteróloga, produce marcada aglutinación.

La prueba de antoglobulina se usa principalmente para identificar cantidades subaglutinantes o no aglutinantes de los anticuerpos antieritrocitos.

Material y equipo

1 gradilla

4 tubos 10 x 75

2 pipetas Pasteur c/bulbo

1 centrifuga Serofuge

1 baño maria a 37°C

Suero de Coombs

Suero anti-D

Solución salina en pizetas

Globulos rojos tipo «O»

Tecnica

En un tubo de ensaye, se pqnen dos gotas de globulos rojos «O», cuatro gotas de solución salina y dos gotas de suero anti-D
Se incuba el tubo a 37°C durante 30 minutos,
Lavar en tres ocasiones con solución salina a 3, 400 r p m, durante 15 segundos en cada ocasión
Para probar que los eritrocitos se encuentran sensibilizados, se toma una gota de la mezcla en otro tubo y se le agrega una gota del reactivo de Coombs, se centrífuga a 3400 y si se aglutinan, estan listos para usarse
Se agrega una gota de los globulos rojos Oo» sensilizados a cada uno de los tubos en que se realizó el CCoombs en las pruebascruzadas
Se centrifugan y se observa si existe aglutinación

Interpretacion de resultados:

Si las pruebas cruzadas resultaron compatibles y estuvieron correctamente realizadas, al agregar las células control de Coombs se observará aglutinación
En caso de no encontrar aglutinación, se procederá a repetir todas las pruebas cruzadas, pues existió un error en la manipulación o en la agrupación sanguínea.

Control de Calidad en el Banco de Sangre.

El control de calidad, serie de procedimientos que nos permiten detectar, analizar y minimizar nuestros errores, constatar la calidad de nuestros productos y ver el alcance de nuestras metas.

En el control de calidad, participamos todos y unas personas solo recaban los datos para ser procesados poste riormente. Lejos de ser procedimientos complicados y sotisficados, el control de calidad debe emplear técnicas lo más sencillas posibles y para realizarse debe de cumplir los siguientes características:

Debe hacerse en forma fácil
Sin sobrecarga de trabajo
En forma periodica,
En forma sistemática
Libre de prejuicio

Los resultados obtenidos de la práctica del control de calidad nos va a permitir:

Ø Prevenir, ya que al llevar un control estricto podemos detectar los posibles errores aún antes de que se presenten
Ø Corregir, cuando el error se presenta, mediante un análisis podemos ver la naturaleza humana, de instrumentos o de la práctica de un método que nos lleve a ese error y corregirlo
Ø Modiflcar si ese error se convierte en sistemático, se podrá modificar parte o todo un proceso que nos conduce a ese error, aún si esto implica cambiar un método

Un buen control de calidad nos debe reflejar todos los aspectos que intervienen en la buena realización de nuestro trahajo, estos aspectos son:

Ø Instalaciones
Ø Equipo
Ø Procedimientos
Ø Personal
Ø Control de calidad en el area de fraccionamiento, conservacion y distribucion

El control de calidad de cada una de las secciones que intervienen en la obtención, manejo, proceso y salida de la sangre es muy importante, sin embargo si tomamos en cuenta que el final de toda esta cadena, lo representa la sección de fraccionamiento, conservación y distribución, su control de calidad se vuelve doblemente importante, ya que cualquier anomalía que en pasos previos haya sido pasada por alto, debe ser detectada en esta sección.

En suma el control de calidad, de esta área debe su vital importancia al echo de ser la suma de cada uno de los procesos a que la sangre se ve sujeta antes de ser enviada para ser trans£undida.

En forma esquematica podemos dividir para su estudio anuestro control de calidad de esta sección en tres grandes areas

Ø Control de calidad, administrativo
Ø Control de calidad del equipo
Ø Control de calidad de los productos,

Cada una de estas áreas implica a su vez, y como anteriormente se mencionó, los aspectos de instalaciones, recursos materiales, procedimientos y personal que intervien en su desarrollo.

Control de calidad administrativo.

Es importante pués a través de él, podemos hacer un seguimiento de la sangre y los productos que de ella deriven, la procedencia, vigencia, disponibilidad, identificación y destino.

Libreta de registro la base de esto es la libreta de registro, la cual, debe contener los siguientes datos:

Ø Fecha de entrada
Ø Nombre del disponente
Ø No de registro
Ø Grupo sanguíneo y Rh,
Ø Resultados de laboratorio
Ø Fecha de sangrado
Ø Fecha de caducidad
Ø Procedencia
Ø Nombre de la persona que recibe
Ø Fracciones obtenidas
Ø Institución o servicio a quién se entrega el producto
Ø Fecha de entrega
Ø Nombre de quien entrega

Deben hacerse varios chequeos semanalmente tomando al azar algunos números de registro, comparandolos con los datos de la bolsa madre y sus reportes, verificarse también al dar salida a algún producto.

Requislciones de salida, verificarlas diariamente tomando alazar varias de ellas, compararlas con la libreta de registro, checar también al dar salida y al entregar algún producto, bolsa madre debe contener los siguientes datos.

Ø No de registro
Ø Nombre del donador
Ø Grupo sanguíneo y Rh
Ø Fecha y hora de sangrado
Ø Fecha de caducidad
Ø Resultados de laboratorio
Ø Institución que hace la captación
Ø Verificar diariamente los datos y anotar los resultados en la hoja de registro correspondiente

Productos debe llevar los siguientes datos:

Ø No de registro
Ø Grupo sanguíneo y Rh
Ø Producto
Ø Fecha de preparación

Revisar diariamente tomando al azar varios productos y anotando los resultados en la hoja de control correspondiente.

Colocacion de los productos verifigar diariamente, que los pro ductos estén en sus respectivos sitios, deben estar agrupados por:

Ø Grupo sanguíneo y Rh
Ø Fecha de caducidad

Los productos no liberados por falta de resultados de laboratono deben permanecer aparte hasta su liberación, en caso de salida de ellos por emergencia, llevarán una nota que diga “sin resultados de laboratorio».

Diariamente revisarlas fechas de caducidad de los productos y en caso de haber terminado su vigencia apartarlos, para darle elcurso correspondiente de acuerdo a las políticas de la institución.

Control de calidad del equipo, su importancia radica en que su correcto funcionamiento nos permite una adecuada calidad de los productos siempre y cuando se acompañe de un buen desarrollo metodológico y humano.

Se consideran tres aspectos:

El manejo depende del estudio cuidadoso del manual operativo propio de cada aparato, de la correcta información del personal que lo utilize y del cuidado que se ponga al llevar a la práctica esta información
La limpieza no solo repercute en la eficacic, sino también en la conservacion, si es adecuada, retarda el deterioro de las piezas que lo componen y en consecuencia las descomposturas, la limpieza debe hacerse a diario en forma superficial y semanalmente a fondo
El mantenimiento se entiende en ocasiones como reparación, sin embargo podemos distinguir dos tipos de mantenimiento:

Ø Preventivo es la primera opción a considerar un mantenimiento periódico, conserva al equipo en condiciones de funcionamiento permanente, este tipo de mantenimiento debe darse como mínimo cada seis meses por parte de la fábrica y por etapas semanales, mensuales, etc, por nosotros mismos
Ø Correctivo aquí entra la reparación, es el último recurso a considerar y será llevado a cabo por el fabricante; al recíbir mantenimiento por parte del fabricante, este no debe ser aceptado sin antes verificar que el equipo cumple con el funcionamiento que de él se espera y solo entonces aceptar que el ser vicio recibido es satisfactorio

Control de calidad de refrigeradores.

Los puntos de temperatura, esto se refiere a la temperatura que se toma diariamente a una hora determinada, su valor es válido solamente el momento de la toma de temperatura y vuelve a tener validez hasta la siguiente, sin tener control del lapso de tiempo entre una y otra.

Su utilidad radica en que podemos verificar el funciqnamiento de los graficadores conectados al refrigerador, dar una idea aproximada del estado de conservación de los productos y permitir vigilar el funcionamiento del refrigerador mediante gráficas desarrolladas con estos puntos, a la vez que prevenir una posible descompostura, se coloca un termómetro certificado dentro de un recipiente de glicerina al 10% y se intro duce al refrigerador, se cierra y se deja 5 minutos al cabo delos cuales se toma la lectura: se anota la lectura en las hojas de registro y se marca en la gráfica, la frecuencia del exámen minimo cada 2 horas en todos los turnos.

Esto es muy útil en los casos en que no se cuenta con refrigerador dotado de graficador, pues al tener el termómetro constantemente dentro del refrigerador y si es posible en cada espacio, nos permite a través de la puerta si es de cristal, lo que marca el termómetro y registrarlo en la hoja respectiva, in cluso con periodicidad más frecuente, la temperatura no debe diferir de valor mas menso de 1°C, variación es el seguimiento detallado del cambio de temperatura que sufren nuestros productos en un lapso de tiempo, para su medición se utiliza un graficador adecuado, de acuerdoa las instrucciones del fabricante y diariamente se observa la gráfica, viendo en ella en primer lugar si los productos han estado expuestos a temperaturas que salgan del rango establecido instrumental debe renovarse todos los días.

Control de Calidad de Congeladores

Su control de calidad es el mismo que para los refrigeradores, la diferencia estriba en que el termómetro utilizado debe ser el adecuado para registrar temperaturas de menos cero grados, debido a que los graficadores tienen un alto costo y en ocasiones no son accesible de ser adquiridos, podemos implementar un método sencillo y a la vez eficaz para ver las variaciones de temperatura que ha sufrico el producto almacenado, esto se basa en que la primera condición que debe tener el productoes el de estar siempre congelado mientras esté almacenado.

Colocar 1.5 ml de plasma, en tubos de 13 x 100 o 10 x75 y cerrarlos perfectamente.
Ponerlos en un congelador en posición vertical hasta congelación
Colocar un tubo (de preferencia en cada charola en posición invertida (de cabeza)
Observarlos diariamente.

Si los productos almacenados han sufrido variación (es) de temperatura que ocasionó su descongelación (aún cuando los encontremos congelados), se verá en los tubos, los cuales presentaran un escurrimiento o descenso del plasma contenido.

Control de calidad de termómetros

Material:

Ø Termometros
Ø Baño maria a 37°C

Técnica:

Varios termómetros de la misa clase
Numerarlos y sumergirlos en baño maria por espacio de cinco minutos registrar los resultados
Se dejan a temperatura ambiente y se registran los resultados

Interpretación de resultados:

Ø El control se hará diariamente.
Ø El resultado limite será de mas menos 1°C
Ø Variaciones mayores a 1°C, el termómetro debe desecharse

Control Calidad de Rotator.

Material:

Ø Isopos, rotator, cronómetro,

Técnica:

Colocar un isopo en una plaza del rotator
Tomar el tiempo con cronómetro y contar los topes con el dedo
Registrar el número de revoluciones por minuto y marcarlos
Rotator de una circunferencia de 10 cms.

Interpretación de resultados:

Tomar en cuenta el número de revoluciones por minuto para cada prueba.

Control de calidad de microscopio

Material:

Ø Isopos
Ø Agua destilada
Ø Microscopio

Técnica:

Se limpia con un isopo en agua destilada, superficies, lentes y oculares
La iluminación se verifica viendo un hexágono encentro de la fuente de luz

Observaciones:

Ø Mantener en su estuche los microscopios:, cuando no esten en uso
Ø El lugar donde se guarden debe ser seco

Control de Calidad de Microcentrifuga.

Objetivo: obtener el tiempo óptimo de centrifugación para cada aparato que se mida.

Material:

Ø Microcentrifuga
Ø Capilates
Ø Lector de microcentrifuga o regla milimétrica
Ø Mechero
Ø Sangre con Anticoagulante

Tecnica:

Ø Mezclar bien una muestra de sangre
Ø Llenar seis pares de capilares 3/4 de tubo
Ø Centrifugar el primer par por espacio de un minuto, anotando el bematocrito obtenido, colocando el segundo par por espacio de dos minutos y realizar el procedimiento anterior, hace lo mismo con los demás pares, aumentando el tiempo basta seis minutos
Ø Registrar los hematocritos obtenidos, record de calibración, fecba, tiempo óptimo y persona que realizó el control

Interpretación de resultados, el tiempo óptimo de centrifugación es el valor repetido del bematocrito vrg:

1’ 2’ 3’ 4’ 5’ 5’

44 43 42 40 40 39

Control de Calidad de Centrifuga

Objetivo: verificar que las revoluciones por minuto que medimos en el aparato sean reales:

Material:

Ø Centrifuga,
Ø Tacómetro
Ø 6 tubos de 10 x 75
Ø Albúmina
Ø Antiglobulina humana
Ø Antisueros A, B, AB y Rh
Ø Globulos rojos Rh positivos y negativos

Tecnica:

1 Se mide la velocidad con un tacómetro, registrandoen número de revoluciones por minuto

2 Para obtener el tiempo óptimo de centrifugación se realiza el siguiente procedimiento

Medios:

A).-Montar tubos de 10 x 75 agregando los reactivos como se indica en el siguiente cuadro:

Medios Anticuerpos Células Control

Salino anti A “A” “O” o “B” Albúminoso anti D Rh positivas

Antiglobulina Coombs Sensibilizadas

B).-Centrifugar a tiempo y revoluciones variables de 15″ a un minuto, y de 1000 a 3500 revoluciones

C) Observar los solirenadantes después de cada centrifugación anotando la fuerza de aglutinación, resuspendiendo lentamente el botón de celulas,

D).- Observar minuciosamente los controles, que deben ser negativos

E).- Observar el tiempo óptimo de centrifugación para cada medio

Interpretación de resultados:

Numerar las centrifugas (con código de inventario) anotando el tiempo y r.p.m. óptimos de centrifugación para cada aparato.

Checado registro de la persona que controló.

Control de Calidad de la Campana de Extraccion,

Lo primero que debe garantizarnos, es que el aire que crcula dentro, esté esteril y no contamine los productos preparados en su interior, aunque ya se mencionó, la limpieza es fundamental, debe de hacerse la asepsia antes y después de utilizarla.

1 Encender la campana y esperar (de acuerdo al fabricante) el tiempo necesario, generalmente 10 minutos, la campana debe estar tal y como se utiliza durante, el fracci ona miento.

2 Introducir dos cajas de Petri, una conteniendo un medio enriquecido para bacterias, gelosa sangre o BHT La otra un medio para desarrollar hongos como Sabburaud, abrir las cajas y esperar 10 minutos antes de cerrarlas, enviarlas a bacteriologia

3 Si existe crecimiento en cualquier de los medios es idice de que la campana no debe ser utilizada en fracionamiento por sistemas semicerrados

4 La frecuencia para este estudio debe ser mensual como mínimo

Control de calidad de espectofotómetro

Tecnica:

1) limpiar los filtros de Didymium

2) Prender el aparato 5 minutos antes de su uso

3) Colocar la escala en 610 nm

4) Observar la fotocelda

5) Ajustar el galvanómetro a cero

6) Retirar el filtro y ajustar a 100% transmitancia

7) colocar el filtro y leer el % de transmitancia

Interpretación de resultados:

Ø El resultado confible es más o menos de cinco unídades
Ø Este registro y control se deberá realizarse a diario
Ø Hay aparatos que tienen su control automatizado

Control de Calidad de los Sueros Hemoclasificadores

Objetivo: evidencia las reacciones antigeno-anticuerpo para verificar la conservación óptima del reactivo.

Generalidades: el control de calidad en los antisueros se harán en suspensiones del 2 al 5% de globulos rojos, determinando avidez, especificidad y título; debiendo tener en cuenta las instrucciones que el fabricante proporciona. Avidez es la rapidez de combinación del anticuerpo con el antígeno. Titulo es la dilución del antígeno en la última aglutinación observable.Especifidad que el anticuerpo reaccione con el antígeno que le corresponda.

Material:

Ø 1 gradilla
Ø 1 cronómetro
Ø 1 placa de vidrio
Ø 10 tubos 10 x 75
3 tubos 13 x 100
3 pipetas Pasteur cíbulbo
Ø Antisueros: A. B. AB y D
Ø Sangre: A, B, AB y D

Técnica para Avidez:

1 Marcar la placa de vidrio con las letras A, B, AB.

2 Colocar una gota de solución de glóbulos rojos al 5% de cada grupo donde le corresponda

3 Colocar una gota de antisuero con su propio grupo, al mismo tiempo se acciona el cronómetro, éste se detendrá cuando se forme la aglutinación

4 Realizar cada grupo por separado

5 No se deben diluir los glólos rojos en su propio suero

6 Anotar el tiempo de avidez de cada antisuero, visualizando los primeros signos de aglutinación

Tecnica para Especificidad:

La especificidad se realiza con la técnica de avidez, pero con el grupo contrario, cuya aglutinación será negativa ejemplo: Un antisuero A con células B, pero al poner un antisuero A concélula A, aglutina.

Tecnica para Titulo de anticuerpo:

1 Marcar y montar 10 tubos de ensaye de 10 x 75 con dos gotas de solución salina en cada tubo

2 Al primer tubo agregar dos gotas de antisuero A y mezdar

3 Pasar dos gotas al siguiente tubo, mezclar y volver a pasar dos gotas al siguiente y asisucesivamente, teniendo los tubos las diluciones: 2, 4, 8, 16, 32, 6 4, 128, 256, etc.

4 Agregar dos gotas de la solución al 5% de glóbulos rojo a a cada tubo, mezclar y observar aglutinación

5 Centrifugar a 2500 r.p.m. por un minuto

6 Registrar la dilución última, hasta donde se observó aglutinación

7 Esta misma técnica se repetirá con cada antisuero

Interpretación de resultados:

1.- La avidez se reportará en segundos

2.- La especificidad con cruces según la aglutinación

3.- El título se registra mediante la dilución oliservada

Valores normales de avidez, especificidad y título.

anti-Al	avidez 15″	aglutinación 3+	Título 256
Anti-A2	avidez 30″	aglutinación 3+	título 128
anti-A1B	avidez 30″	aglutinación 3+	título 128
anti-A2B	avidez 30″	aglutinación 3+	título 128
Anti-B	avidez 15″	aglutinación 3+	título 256
anti-D Rh1	avidez 60″	aglutinación 2+	título 32

Coombs:

Células sensibilizadas: aglutinación2+ título 4

Control de Calidad en el Lavado de Material de Cristal.

Objetivo: Verificar la limpieza y secado de material de uso diarioen el Banco de Sangre.

Material:

Ø 3 tubos13 x 100 secos
Ø 3 tubos10 x 75 recien lavados
Ø 1 pipeta de 5 ml
Ø 3 pipetas Pasteur c/bulbo
Ø 1 placa de vidrio
Ø Fenoftaleina al 1%

Tecnica:

1 El control de cálidad se realiza en el primer enjuague

2 Agregar una gota de fenoftaleina al 1% sobre las paredes del tubo

3 Realizar la misma maniobra en los tubos del segundo enjuage y en los tubos secos.

Interpretación de resultados:

Ø Un buen lavado de material no hará vire de color
Ø Si hay residuos de javón se verá de rosa pálido a rosa fuerte

Por lo tando la limpieza del material, no es el adecuado y se intesificará, del tal manera que todos los tubos no haya vire de color, pues los restos de detergente, puede dar resultados falsamente positivos de cualquier reacción que se busque en elmaterial.

Control de Calidad de Hemoderivados

Todos los procesos del control de calidad, van encaminados a obtener productos de buena calidad, esto es que satisfagan las necesidades de las Instituciones que los utilizan y no provoquen riesgos extra a los que cada transfusión por si misma esta sujeta.

Cualquier deficiencia en la selección del disponente, obtención, manejo, transporte, fraccionamiento, conservación y salida de estas sangres se refleja en los productos; el controlde calidad está encaminado a encontrar esas deficiencias.

Control de Calidad de Sangre Total

Es el punto de partida de nuestro trabajo, es primordial saber en que condiciones la recibimos.

Determinacion del volumen extraido

Nos referimos a este como volumen neto; esto es la cantidad de sangre extraída a un disponente. Independientemente del problema que podemos ocasionar al disponente, el volúmen es irnportante ya que el bajo o nulo, rendiminto de nuestros productos pueden ser ocasionados por un volúmen inadecuado.

1 Pesar 10 bolsas con anticoagulante de cada uno de los tipos utilizados en la captación y obtener el promedio de esos pesos, a esto llamamos: Peso de la bolsa.

2 Al recibir una unidad pesarla y anotar el resultado, a esto lo llamamos Peso bruto

3 Calcular el peso neto o peso de la sangre solamente.

4 Peso neto = peso bruto – peso de la bolsa

5 Conociendo el valor de la densidad de la sangre total

=1 058, y de la fórmula de la densidad en base a la masa y el volúmen,

Calcular el volumen:

Volumen neto= peso neto entre densida..

1 Para bolsas que contienen 75 ml de anticoagulante ACD el volúmen neto adecuado es de 500 mas menos 10% (450)

2 La frecuencia recomendada es del 1% del total y todas aquellas unidades suceptibles de estar fuera del rango, tendrán que darle destino final.

Esterilidad.

Para verificar que las bolsas que se encuentran en depósito en el refrigerador, se encuentran esteriles se tendrá en cuenta:

1 Coloración muchos gérmenes al activar sobre la sangre, la afectan produciendo un cambio de coloración, lo mas frecuente puede ser; decoloración, cambio de coloración a cafe rojizo o color verdoso tanto si este cambio es evidente como si es sugestivo, apartar la unidad y enviarla a control bacteriológico, antes de desecharla

2 Aire: Considerese que las bolsas de sangrado como producto de su fabricación, contienen aire dentro de ellas y que está estéril, en algunas marcas la cántidad es excesiva por lo que su sola presencia en la sangre no es indice de contaminación.

Revisar la presencia de aire en:

Ø Tubo colector, este puede observarse totalmente vacío con un llenado intermitente.
Ø La bolsa, la cual puede verse con la presencia de burbujas
Ø En cualquier caso, apartarla, mantenerla entre 4 y 6°C, por tres días, para dar tiempo al crecimiento bacteriano y enviarlas a control bacteriológico
Ø Defectos de la bolsa.-Los defectos tales como bolsas mal selladas, con picaduras, etc. se deben a defectos en la fabricación o al mal manejo a que se ven sujetas, comprobar que el defecto ocasiona la salida de sangre y en caso positivo desecharla.

Coagulos

La presencia de estos imposibilita la utilizacion de la sangre y sus productos y solo es viable la obtención de plasma envejecido

Ø Colocar la bolsa en posición horizontal y ver si hay discontinuidad en la sangre al realizar movimientos de vaivén
Ø Revisar las esquinas y las uniones del tubo colector y conector en ocasiones se acumula sangre en estos lugares dando falsa impresión de contener coágulos
Ø Toda sangre que contenga un volúmen demasiado alto tiene la probabilidad de contener coágulos o microcoágulos y será manejada como sangre coagulada.

Hemólisis

Los cambios de temperatura que puede llegar a tener un refrigerador, sobre todo cuando no contamos con registro gráfico y alarma, puede provocar destrucción de los globulos rojos.

a).-Observar el tubo colector para ver su presencia

b).-Si la sangre ha estado en reposo o si está centrifugada, observar el plasma después de mezclar delicadamente la sangre.

c).-Si hay indicios de hemólisis, tomar una muestra de la bolsa y hacerle un microhematocrito observando el plasma. Si el resultado es positivo, desechar la unidad

La frecuencia mínima de estudio recomendada es del 1% del total y todas aquellas unidades suceptibles de estar fuera de rengo

Control calidad del paquete globular

1 Peso neto. Los mismos cálculos que para sangre total, debe estar entre 206 y 350 grm

2 Hematocrito entre 70 y 80%, estos valores garantizan una fluides adecuada durante la transfusión

3 Esterilidad, coágulos y hemólisis, las mismas medidas que para sangre total

4 Frecuencia de estudio, la misma que para sangre total

Control de Calidad del Plasma envejecido, Fresco y Fresco congelado

1 Volúmen neto, calcular el volúmen neto utilizando unadensidad de 1 030, podemos considerar dos volúmenes, el del plasma obtenido directamente y aquel que se obtiene como resultado de la preparación de un producto

Plasma obtenido directamente, Vol 200ml
Plasma obtenido como subproducto vol = 150 ml
Si el volúmen en ambos casos es menor, este plasm,.puede ser utilizado, pero puede ser indicacion deuna mala técnica de fraccionamiento

2 Hemólisis, debe estar libre de hemólisis, la presencia de esta se puede observar por el color rojizo del píasma, no confundirla con la contaminación de eritrocitos, en la hemólisis el color rojo es siempre uniforme, aún después de centrifugar o dejar desedimentar, en la conta minación conforme se sedimente se observan dos capas, una de color amarillo característico del plasma y la otra de color rojo, en caso de haber bemólisis no debe utilizarse ni el plasma ni el paquete globular.

3 Contaminación con eritrocitos, no debe haber contaminación con eritrocitos, por el peligro de provocar una sen sibilización en el receptor un plasma contaminado indica una mala técnica de fraccionamiento

4 Aspecto el color del plasma debe ser amarillo y translúcido, el plasma lipémico no debe ser utilizado como fresco. Un plasma ictérico debe ser separado de los productos hasta no tener resultados de laboratorio de bilirrubinas, trasaminasas, AgSHb, etc. Cualquier otro aspecto no habitual imposibilita su utilización junto con sus productos, hasta conocer la causa que lo oiirigine.

5 Dosificación de factores de coagulación (opcional paraplasma congelado). Se hace la dosificación con un mínimo de tres meses después de congelarse, los niveles serán normales de acuerdo a la técnica utilizada

6 Frecuencia míima, 1% del total o cuatro por mes, de cada uno de los productos.

Control Microbiobiológico en Unidades Sanguíneas

Objetivo: Verificar la esterilidad de las unidades sanguíneas.

Generalidades: La contaminación de una unidad de sangre se puede producir por los siguientes medios: equipos y reactivos incorrectamente esterilizados, técnias de asepcia inadecuadas, llenado de bolsas incorrecto, bolsas contaminadas.

Material:

Ø Jeringa de 10 ml,
Ø Unidad sanguínea
Ø Estufa a 55°C
Ø Microscopio
Ø Medio de soya tripticasa y de tioglicolato
Ø Agar nutritivo, dextrosa Sabouraud, EMB
Ø Cristal violeta, lugol, alcohol, acetona y zafranina,
Ø Tubos de ensaye

Tecnica:

1 Verificar el peso neto de las bolsas, coágulos, de coloración, picaduras, burbujas y hemólisis

2 Se toman 6 ml, de sangre de la bolsa muestra, inoculando cada tubo con 2 o 3 cms e incubar a 35°C.

3 Se inocula en soya tripticasa para gram positivo, a temperatura ambiente y en tioglicolato para gram nega tivo a 35°C una semana, también se observan anaerobios

4 Si se considera necesario también se sembrará en otros medios de cultivo como EMB para enterobeacterias (gram neg), 110 para estafilococo (gram positivos)

5 Se deberá efectuar en estos casos, frotis de la sangre del paciente y de la bolsa, teñiendo con gram ó azul de metileno para ver morfologia también se puede utilizar el medio de Bigg para hongos (cándida albicans)

6 En agar nutritivo y dextrosa sabouraud, la siembra se leerá cada 24 horas, observando hemólisis, crecimiento y haciendo resiembras.

Interpretación de resultados:

1 No se deberá encontrar indicios de ningún microorganismo.

2 También se realizará el control microbiológico en soluciones y torundas

3 A parición de colonias indica contaminación

4 Todo resultado positivo, debe desecharse la sangre

5 El control se deberá realizar cada 15 días.