GPF:
del océano a la ciencia
Azucena Muñoz Ramírez,
Aracely López Monteón,
Ángel Ramos Ligonio,
Enrique Méndez Bolaina y
Mario Roberto Bernabé Guapillo Vargas
Un descubrimiento brillante
Mientras más oscuro sea el entorno, más
extraordinaria será la luz que lo pueda iluminar,
y esto justamente fue lo que observaron
Osamu Shimomura y sus colaboradores en los
años 60, cuando trabajando en la Universidad
de Princeton en el laboratorio de Frank
Johnson estudiaban la bioluminiscencia de la
medusa Aequorea victoria (Figura 1). La pregunta
que se hacían era por qué esta medusa podía
emitir una característica luz verde. Tiempo
más tarde, y después de recolectar miles de
medusas, lograron identificar una fotoproteína
a la que denominaron aequorina, que
al ser activada con calcio emitía una luz azul.
Observaron después que la luz de la medusa
adquiría un tono verdoso bajo la luz ultravioleta,
y que esta coloración se debía a otra
proteína, a la que llamaron “proteína verde
fluorescente” (Green Fluorescent Protein, o GFP). La
función de la GFP es la de convertir la luz azul
emitida por la aequorina en luz verde, y con
esto aumenta tanto la producción de luz por la misma aequorina y la transmisión de luz en el
océano. La medusa Aequorea victoria es generalmente
translúcida, pero frecuentemente está
decorada con estructuras brillantes, ya que la
GFP emite bioluminiscencia en la zona verde
del espectro visible.
Figura 1. Medusa Aequorea victoria.
Fotografía de un espécimen vivo.
Tras las publicaciones de Shimomura sobre
esta proteína, muchos investigadores se han
interesado en conocer más acerca de la GFP. Así
fue como Douglas Prasher y sus colaboradores
lograron aislar y clonar en 1992 el gen responsable
de la GFP, determinando la secuencia
exacta de los 238 aminoácidos que la componen.
Casi al mismo tiempo, Martin Chalfie
se preguntó si sería posible implantar GFP de
la medusa en un gusano llamado Caenorhabditis
elegans para que sintetizara la proteína y produjera
luz (Figura 2). De esta forma, se podría
observar en vivo qué genes intervienen en la
bioluminiscencia. Chalfie estaba en lo cierto:
la GFP podía hacer brillar a criaturas distintas
a la medusa. Era, pues, una proteína perfecta
para la revolución de la biología molecular, y
pronto fue implantada en experimentos con
genes de diversas plantas, ranas, peces, cabras,
ratones, conejos, monos, moscas y levaduras.
Figura 2. Expresión de GFP en un gusano
Caenorhabditis elegans.
Durante algún tiempo no se supo exactamente
cómo la GFP generaba la fluorescencia,
hasta que Roger Tsien y sus colaboradores
de la Universidad de California obtuvieron
una respuesta. Demostraron que el fluoróforo
–esto es, la parte de la molécula que la
hace fluorescente– se forma a partir de una
secuencia muy específica de aminoácidos. Lo
único que se necesita para que esto ocurra es
oxígeno molecular. Además, por medio de la
ingeniería de proteínas, los científicos lograron
producir una gran cantidad de proteínas
mutantes tipo GFP con propiedades mejoradas,
de manera que pudieron ampliar la gama
de colores de la proteína y producir variantes
más estables e intensas en tonos como amarillo, violeta o azul, una contribución muy
importante que representa la base para el
estudio simultáneo de diversas proteínas en
una célula, lo que se logra marcándolas con
distintos colores. Gracias a estos exhaustivos
trabajos, Osamu Shimomura, Martin Chalfie
y Roger Tsien recibieron en 2008 el Premio
Nobel de Química por el descubrimiento y
desarrollo de la GFP.
Linterna verde
La GFP es la única de las proteínas que emiten
luz, y que tampoco requiere de la presencia
de cofactores o sustratos para generar
esa luz verde, lo que se demostró cuando el
fragmento de DNA de la GFP pudo ser expresado
en bacterias y en gusanos, lo que hizo
que esos organismos brillaran cuando se iluminaban
con luz ultravioleta. El fluoróforo de
esta proteína, que es la parte química excitable
y es la que tiene la capacidad de brillar de
un color verdoso, está formado por solo tres
aminoácidos. Las características estructurales
principales de la GFP se conserva bien en todas
sus mutantes o versiones, pero difieren en sus
propiedades luminiscentes, por lo que algunas
variantes tienen diferentes colores. En cuanto
a su estructura, la GFP se asemeja a un cilindro,
ubicándose el fluoróforo a la mitad en el
centro geométrico de ese cilindro
(Figura 3). Mediante el análisis del fluoróforo y de otras
regiones de la proteína se han producido formas
perfeccionadas de la GFP, una de las cuales
emite luz azul (Blue Fluorescent Protein, o BFP),
una variante que brilla en color rojo y otra
aún más brillante que la verde original.
Figura 3. GFP, representación de la estructura de barril
que rodea al fluoróforo central.
Ilumina la vida
Muchos laboratorios han mostrado que la
GFP puede producir fluorescencia verde en
una gran variedad de organismos, como
bacterias, mixomicetos, plantas y mamíferos (Figura 4). Las numerosas aplicaciones
de esta proteína incluyen su uso como
reportero de la expresión de genes, como
marcador para el estudio del linaje celular
durante el desarrollo y como etiqueta para
localizar ciertas proteínas en las células. En
efecto, la extraordinaria GFP se ha usado
para localizar proteínas y visualizar sucesos dinámicos dentro de las células vivas
mediante microscopía de fluorescencia.
Pueden fusionarse algún gen clonado de
interés y el gen de la GFP, y el producto de
esa fusión se introduce en algún organismo
para que se exprese de manera transitoria
o estable. La proteína resultante puede
ser vista y seguirse en tiempo real usando
microscopía convencional de fluorescencia,
algo que antes solamente podía soñarse. Las
aplicaciones incluyen también la visualización
de las propiedades dinámicas de los
organelos celulares de tamaño microscópico;
en otras palabras, gracias a la GFP es
posible observar la actividad de los componentes
internos de las células. Esta linterna
verde también puede indicar directamente
el nivel de expresión genética en células
vivas o tejidos.
Esta brillante proteína es empleada en la
llamada “terapia génica”, la cual está revolucionando
actualmente la medicina. Además,
gracias a que la señal de GFP puede detectarse
fácil y rápidamente sin necesidad de manipular
las muestras, la utilidad más prometedora
consiste en su uso en procedimientos
de selección de células que lleven un gen que
interese conocer.
Figura 4. Ratones transgénicos con DNA de GFP. Todos sus tejidos, con excepción de los eritrocitos y el cabello,
son verdes al ser excitados con luz ultravioleta.
La plasticidad de GFP, debido a sus diferentes
propiedades luminiscentes, permite
rastrear simultáneamente varias proteínas en
células vivas marcando cada una de ellas con un color diferente, lo que ha llevado a numerosos
científicos a explorar el lado artístico de
la biotecnología. Un par de formas distintas de
GFP pueden usarse en experimentos de transferencia
de energía por resonancia de fluorescencia
para detectar la proximidad de dos
proteínas dentro de una célula viva. Usando
este principio de transferencia de energía, se
pueden investigar las interacciones entre esas
proteínas en el ambiente celular.
Figura 5. Levaduras expresando distintas versiones de GFP (arriba)
y células vivas con citoplasmas fluorescentes por la expresión
de GFP (abajo).
La GFP se ha convertido así en una herramienta
invaluable en muchas ramas de la investigación
biológica. Quizá lo más importante
es que por primera vez se pueden estudiar a
fondo las células vivas y los organismos, lo que
traerá consigo una nueva era en la investigación
biológica en el estudio molecular (Figura
5). La contribución de las proteínas fluorescentes
a nuestra comprensión de la dinámica
celular y las redes de interacción molecular ha
comenzado, así como la generación de nuevas
GFP mejoradas y de distintos colores, lo que sin
duda hará posible la construcción de sensores
para analizar una mayor variedad de procesos
bioquímicos y estudiarlos en los niveles
subcelular y celular, así como en organismos
completos. La GFP es así una luz que guía en el
camino de las biociencias.
Para el lector interesado
- Shimomura, O., Johnson, F.H. y Saiga,
Y. (1962). Extraction, purification
and properties of aequorin, a
bioluminescent protein from the
luminous hydromedusan Aequorea.
Journal of Cell Comparative Physiololgy,
59, 223-239.
-
Prasher, D.C., Eckenrode, V.K., Ward,
W.W., Prendergast, F.G. y Cormier,
M.J. (1992). Primary structure of
the Aequorea victoria green-fluorescent
protein. Gene, 111, 229-233.
-
Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G.,
Ward, W.W. y Prasher, D.C. (1994).
Green fluorescent protein as a marker
for gene expression. Science,
263, 802-805.
-
Heim, R., Prasher, D.C. y Tsien, R.Y.
(1994). Wavelength mutations and
posttranslational autoxidation of
green fluorescent protein. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the USA,
91, 12501-12504.
